何聰芬，李靖宇，王 領(lǐng)，何錦風(fēng)

1北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048;3東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030;4總后勤部軍需裝備研究所軍用漢麻材料研究中心，北京 100082

漢麻(China-hemp)是大麻科(Cannabinaceae)蕁麻目(Urticales)大麻屬(Cannabis)大麻種(Cannabis sativa L.)的1年生草本植物［1］。漢麻的抗紫外輻射功能在所有麻類中是最好的，能有效減少紫外線對(duì)人體的危害［2-4］。任漢陽［5］的研究表明漢麻籽油可以提高SOD、GSH-Px 等酶的活力，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化、延緩衰老的作用;曹俊嶺［6］的研究證明漢麻籽油可通過抗氧化作用和對(duì)NO 的影響起到延緩衰老的作用，漢麻籽油中的多不飽和脂肪酸具有較強(qiáng)穿透皮膚的能力，可作為洗滌品和護(hù)膚用品的原料。漢麻籽油消除DPPH·自由基的能力超過橄欖油［7］，并在200～420 nm 有強(qiáng)吸收峰，能夠吸收波長320～400 nm 的UV-A 和波長275～320 nm 的UVB［8-10］，適合用作抗氧化和抗紫外功效化妝品的原料。雖然漢麻擁有優(yōu)秀的抗紫外功能，但在國內(nèi)外尚未見對(duì)漢麻不同生長階段、不同部位的抗紫外作用的評(píng)價(jià)及比較的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同時(shí)期、不同部位的漢麻提取物進(jìn)行了抗紫外功效篩選，根據(jù)最佳提取物主要功效成分的含量進(jìn)行提取工藝優(yōu)化、并對(duì)提取物的安全性及穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究。本研究可為漢麻在化妝品中的開發(fā)應(yīng)用提供有價(jià)值的科學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而為抗紫外產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供原料制備方面的重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

漢麻“云南一號(hào)”，中國人民解放軍總后勤部軍需裝備研究所軍用漢麻材料研究中心提供。

無水乙醇、乙酸乙酯、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、葡萄糖、檸檬酸三鈉、檸檬酸、鹽酸氯丙嗪、氫氧化鈉、濃鹽酸、對(duì)-二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、冰乙酸、乙酸鈉結(jié)晶、無水氯化鈣、DPPH、SDS、濃硫酸、苯酚、蘆丁、Al(NO3)3、Folin-酚試劑、NaNO2、結(jié)晶牛血清蛋白、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅等，均購自北京化學(xué)試劑公司。

RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;JA-5300 電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器公司;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司;RJ-LD-IIB 低速大容量多管離心機(jī)，無錫瑞江分析儀器有限公司;UV2300 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司;NIKON SMZ1000 解剖顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 漢麻提取物的制備

針對(duì)漢麻(以下簡稱hemp)不同生長期(40、80、120、160 d)的莖(稈)、葉、皮、根分別采用以下方法進(jìn)行提取:水熱浸提法、60%乙醇提取法、95%乙醇提取法、乙酸乙酯提取法(干物料粉碎后過30 目篩，料液比1∶15 混合，微沸1 h，4000 rpm 離心15 min，取上清，抽濾至澄清后烘干)、水提醇沉法(干物料粉碎后過30 目篩，料液比1∶15 混合，微沸1 h，4000 rpm 離心15 min，取上清，濾液加入3 倍體積乙醇過夜，8000 rpm 離心10 min，取沉淀，冷凍干燥)。

1.2.2 抗紫外功效評(píng)價(jià)

1.2.2.1 紫外線掃描檢測(cè)

將各提取物用相應(yīng)溶劑稀釋成每毫升相當(dāng)于生藥0.5 mg，以相應(yīng)溶劑為空白對(duì)照，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定提取物在各波長的透光率［11］。計(jì)算方法:先計(jì)算各提取物在UV-B 區(qū)的280、290、300、310、320 nm 和UV-A 區(qū)的320、330、340、350、360、370、380、390、400 nm 的平均透光率，再換算成平均紫外線吸收率。

1.2.2.2 清除DPPH·自由基試驗(yàn)

分別取等體積的待測(cè)液與DPPH·溶液(2 ×10-4mol/L)(A1管)、等體積的無水乙醇與DPPH·溶液(2 ×10-4mol/L)(A2管)、等體積的無水乙醇與待測(cè)液(0.05～3 mg/mL)(A3管)混勻，反應(yīng)30 min后，測(cè)量A1、A2、A3管在517 nm 的吸光值，計(jì)算:DPPH·自由基清除率(%)=［(A2+A3)-A1］/A2。根據(jù)清除率(%)的線性擬合方程求出IC50值［12］。該試驗(yàn)的陽性對(duì)照是抗壞血酸Vc。

1.2.2.3 光溶血試驗(yàn)

將采集的雞血液樣本在室溫下1500 rpm 離心15 min，棄去上清液，用等量PBS 緩沖液混洗離心管中的紅細(xì)胞，添加適量葡萄糖至1 ×10-2mol/L，4 ℃密封保存。吸取1 mL 雞血細(xì)胞，用PBS 緩沖液稀釋至25 mL，再進(jìn)一步十倍稀釋成紅細(xì)胞懸液。取兩塊6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在各孔中加入1 mL 該紅細(xì)胞懸液、1 mL 的PBS 緩沖液和1 mL 氯丙嗪溶液(1 mg/mL)，并在其中一塊板中添加不同濃度的待測(cè)液(0.1、0.3 mg/mL)。這兩塊培養(yǎng)板靜置10min 后，同時(shí)置于紫外燈下照射。保持照射功率不變，每照射一定時(shí)間后觀察紅細(xì)胞的光致溶血反應(yīng)，計(jì)算:溶血率(%)=［(照射后樣品-未照射樣品-無紅細(xì)胞樣品)/(100%溶血值-未照射樣品)］×100［13］。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

稱取7 份(每份2 g)粉碎后過30 目篩的漢麻(160 d)葉，分別加入20、30、40、50、60、70、80 mL 去離子水，配成料液比為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的混合液，均勻攪拌后浸提，烘干后衡量，比較料液比對(duì)提取率的影響。

料液比1∶20，70 ℃浸提，設(shè)浸提時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，烘干后衡量，比較提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

料液比1∶20，設(shè)浸提水浴溫度分別為65、70、75、80、85、90 ℃，烘干后衡量，比較提取溫度對(duì)提取率的影響。

料液比1∶20，75 ℃浸提，設(shè)合并浸提液的次數(shù)分別為1 次、2 次、3 次，烘干后衡量，比較提取次數(shù)對(duì)提取率的影響。

1.2.4 提取物的化學(xué)成分分析

參照QB/T 2488-2007，采用苯酚-硫酸法、Folin-酚法和NaNO2-Al(NO3)3比色法分別測(cè)定漢麻提取物中的總糖、總蛋白和總黃酮含量。

1.2.5 提取物的安全及穩(wěn)定性檢測(cè)

安全性檢測(cè):紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)［14］及雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)(SN/T2329-2009)。

穩(wěn)定性檢測(cè):測(cè)定1% 提取物溶液的自身pH值。將提取物分別用HCl 和NaOH 液配制成pH 1～14 的溶液(濃度為5.0 %)，靜置0.5、3、24 h 后，觀察提取物狀態(tài)，分析其pH 穩(wěn)定性。

將1%提取物溶液分成12 等份(每份40 mL)于無色透明樣品瓶中，編號(hào)1～12，置于4 ℃冰箱中。分別于第1、2、3、4、5 d、第1、2、3 周和1 個(gè)月后測(cè)定提取物溶液的各種指標(biāo)參數(shù)變化(包括顏色、氣味，是否出現(xiàn)沉淀，pH 值、粘度和活性物含量變化等)。當(dāng)提取物溶液第一次出現(xiàn)明顯異常(以上任意一項(xiàng)指標(biāo)變化均屬異常現(xiàn)象)時(shí)，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)至下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)后結(jié)束試驗(yàn)，分析原因。

重復(fù)相同步驟，配制1～12 號(hào)樣品置于溫度40℃的烘箱，分析其耐熱穩(wěn)定性;或交替置于冰箱(溫度4 ℃)和烘箱(溫度40 ℃)中，分析其冷熱交替穩(wěn)定性;或置于陽光直射處，分析其光穩(wěn)定性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抗紫外功效評(píng)價(jià)

2.1.1 紫外光譜掃描結(jié)果

不同部位漢麻提取物的平均紫外線吸收率見表1。相對(duì)于漢麻(160 d)皮提取物，漢麻(160 d)葉的乙醇提取物、水提醇沉物和乙酸乙酯提取物的平均紫外吸光率較大，且在UV-A 和UV-B 兩個(gè)波段均有較強(qiáng)的吸收。因此，初步認(rèn)為漢麻葉比漢麻皮的提取物更具有抗紫外功效的開發(fā)價(jià)值。

表1 不同部位漢麻提取物的平均紫外線吸收率Table 1 The average UV absorbance of extracts from different parts of China-hemp

2.1.2 清除DPPH·自由基試驗(yàn)結(jié)果

不同生長期、不同部位的漢麻提取物對(duì)DPPH·清除能力見表2，從表中可知，隨著濃度(0.05～3.6 mg/mL)的增加，不同生長期、不同部位漢麻乙醇提取物對(duì)DPPH·自由基的清除能力均逐漸增強(qiáng)，呈顯著的直線相關(guān)(R2=0.981～0.998)。在半抑制濃度(IC50)的比較中，A 組和B 組提取物IC50值較低，分別為2381.9 μg/mL 和2583.7 μg/mL。IC50值越低，說明樣品清除DPPH·自由基的能力越強(qiáng)［15］。因此，初步判斷生長期160 d、漢麻葉的乙醇提取物相對(duì)于120 d 生長期和其它提取部位(皮)具有更好的DPPH·自由基清除作用，且漢麻(160 d)葉60%乙醇提取物優(yōu)于漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物。

表2 不同生長期、不同部位的漢麻提取物對(duì)DPPH·清除能力Table 2 DPPH· scavenging ability of China-hemp extracts of different stages and different parts

2.1.3 光溶血試驗(yàn)結(jié)果

在光溶血試驗(yàn)中(表3)，不同生長期漢麻葉95%乙醇提取物的添加(0.1 mg/mL 或0.3 mg/mL)使1h 后紅細(xì)胞溶血率下降了42%～63%，說明這幾種提取物能有效阻止紫外線照射對(duì)紅細(xì)胞造成的損傷。其中，160 d 漢麻葉提取物的溶血率下降幅度最大。

通過以上紫外掃描檢測(cè)、清除DPPH·自由基試驗(yàn)和紅細(xì)胞光溶血試驗(yàn)，分別對(duì)不同生長期、不同部位漢麻提取物的紫外吸收能力、抗氧化能力和防紫外損傷能力的分析和比較，發(fā)現(xiàn)漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的綜合抗紫外功效最優(yōu)，并對(duì)其進(jìn)行下一步的提取工藝優(yōu)化研究。

注:光溶血體系中添加1 mg/mL 鹽酸氯丙嗪溶液1 h 后，紅細(xì)胞溶血率達(dá)到92.3%。Note:After adding 1 mg/mL of chlorpromazine hydrochloride solution to the photohemolysis system for 1h，the red blood cell hemolysis rate reached 92.3%.

2.2 提取工藝優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)分別從料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)四方面確定漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的工藝優(yōu)化參數(shù)。

圖1 料液比對(duì)漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yield of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖1 可知，隨著料液比的升高，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的得率先升后降，但總體變化不大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶30 時(shí)，得率不再增加反而略有所下降，可能是可溶性雜質(zhì)溶出量增大，降低了得率，同時(shí)溶劑用量過大也會(huì)延長濃縮時(shí)間，造成黃酮類物質(zhì)的部分分解［16］，并給后序處理增加困難。因此，在保證提取效果的同時(shí)，選定料液比為1∶20。

圖2 提取溫度對(duì)漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of 95%ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖2 可知，隨著溫度的升高，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的得率也是呈現(xiàn)先升后降的變化。主要原因?yàn)?，溫度升高?dǎo)致提取液黏度減小，擴(kuò)散系數(shù)增加，促使提取速度加快;但溫度過高時(shí)，雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大［4］，活性成分易被破壞，溶劑損失量增大，提取效果反而下降。因此，選擇提取溫度為75 ℃。

圖3 提取時(shí)間對(duì)漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.3 Effects of extraction duration on the yield of 95%ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖3 可知，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的得率在提取時(shí)間在2.5 h 時(shí)達(dá)到最高，然后隨著提取時(shí)間的延長反而下降。這可能是由于長時(shí)間的提取，造成了黃酮類物質(zhì)的部分分解［17］，以致提取效果下降?？紤]到提取效果和縮短生產(chǎn)周期的需要，選定提取時(shí)間為2 h。

圖4 提取次數(shù)對(duì)漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.4 Effects of times of extraction on the yield of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖4 可知，一次提取的得率約為10.43%，而二次提取得率僅為2.0%左右，說明提取1 次漢麻(160 d)葉中的黃酮類化合物就已基本溶出。因此，選定提取次數(shù)為1 次。

圖5 優(yōu)化前后0.3 mg/mL 漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物光溶血試驗(yàn)Fig.5 The RBC hemolysis with 0.3 mg/mL of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160d)

綜上所述，并考慮提取效率、控制成本和節(jié)約能源等因素，得到漢麻(160 d)葉95%的乙醇提取物的最佳工藝條件為:料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2 h，提取1 次。

優(yōu)化前后乙醇提取物光溶血試驗(yàn)結(jié)果見圖5，在光溶血試驗(yàn)體系中添加0.3 mg/mL 優(yōu)化后的漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物后，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞溶血率比優(yōu)化前的提取物有明顯降低，說明其抗紫外輻射能力有所增強(qiáng)，優(yōu)化成功。

2.3 漢麻提取物的化學(xué)成分分析

最佳提取物的總糖含量、蛋白含量、總黃酮含量結(jié)果見表4。雖然漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的主要成分為黃酮(0.571 g/g)，但漢麻提取物中的抗紫外關(guān)鍵功效成分及其作用機(jī)理，仍需進(jìn)一步深入研究。

表4 漢麻(160 d)葉95%乙醇粗提物主成分含量Table 4 Components of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

2.4 漢麻提取物的安全及穩(wěn)定性檢測(cè)

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，從圖中看出，將漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物配成0.5%和1%的溶液，其溶血率分別為3.2%和7.88%，均低于上限(20%)，表明該提取物未使紅細(xì)胞發(fā)生明顯的受損和溶血現(xiàn)象，因而無明顯刺激性。

圖6 0.5%及1%漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物溶血率Fig.6 The hemolytic rates of 0.5% and 1% China-hemp extracts

在雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)中(見表5)，0.5%優(yōu)化漢麻葉提取物(1～3 號(hào))的IS 平均值為0.647，而1%優(yōu)化漢麻葉提取物(4～6 號(hào))的IS 平均值為0.925?？梢婋m然提取物的IS 值也隨著濃度而升高，但其IS 值均小于1，所以該漢麻葉提取物無明顯刺激性。

在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的溶液pH 穩(wěn)定性良好，在冷熱交替穩(wěn)定性測(cè)試中，其pH 指標(biāo)始終保持在5.80±0.2，未出現(xiàn)沉淀。在耐寒(4 ℃)熱(40 ℃)及光穩(wěn)定性測(cè)試中，提取物僅在最后一周出現(xiàn)少許沉淀及顏色變化，穩(wěn)定性總體較好。

表5 雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)IS 值的測(cè)定結(jié)果Table 5 IS values of China-hemp extracts determined in CAM test

注1:IS 的計(jì)算公式為:

3 結(jié)論

通過紫外光譜掃描、清除自由基實(shí)驗(yàn)、光溶血實(shí)驗(yàn)對(duì)不同時(shí)期、不同部位的漢麻提取物進(jìn)行了抗紫外功效評(píng)價(jià)和優(yōu)選。其中，漢麻(160 d)葉95%的乙醇提取物在UV-B 區(qū)、UV-A 區(qū)的平均紫外線吸收率為61.23%、70.84%，抗紫外作用優(yōu)于其它提取物。該提取物還有較強(qiáng)的DPPH·自由基清除能力(IC50值2583.7 μg/mL)，并能有效地能夠阻止紫外線照射對(duì)紅細(xì)胞造成的損傷(添加0.3 mg/mL 提取物后，紅細(xì)胞光溶血率下降63.2%)。對(duì)漢麻(160 d)葉進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2 h，提取1次;并對(duì)優(yōu)化后漢麻葉提取物進(jìn)行了初步的化學(xué)成分分析(主要成分為黃酮)和安全性及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，認(rèn)為該提取物穩(wěn)定安全，已初步具有了作為防曬化妝品功效原料的開發(fā)價(jià)值［18］。但若要將漢麻成熟葉95%乙醇提取物作為一種功效添加劑研制出高效的防曬化妝品，則還需重點(diǎn)解決天然防曬劑的復(fù)配問題，即對(duì)化妝品基質(zhì)中油相原料、乳化劑和成膜劑等成分的選擇進(jìn)行優(yōu)化研究［19］。

1 Zhang JC(張建春).Hemp Cultivation and Primary Processing Technology.Beijing:Chemical Industry Press，2009.

2 Xiang WZ(相文忠)，Bi ZG(畢志剛).Photoprotection.J Clin Dermatol(臨床皮膚科雜志)，2006，35:620-621.

3 Small E，Marcus D.Hemp:A new crop with new uses for north America.Trends New Crops New Uses，2002，284-326.

4 Chung JH，Youn SH，Kwom OS，et al.Enhanced proliferation and collagen synthesis of human dermal fibroblasts in chronically photodamaged skin.Photodermatol Photoimmunol Photomed，1996，12:84-89.

5 Ren HY(任漢陽).Experimental study on antioxidation function of constipation model of mice with Fructus Cannabis.China J Tradit Chin Med Pharm(中國醫(yī)藥學(xué)報(bào))，2004，19(2):77-79.

6 Mechoulam R.Plant cannabinoids:a neglected pharmacological treasure trove.Brit J Pharm，2005，146:913-915.

7 Raharjo TJ，Widjaja I，Roytrakul S，et al.Comparative pro-teomics of Cannabis sativa plant tissues.J Biomol Tech，2004，15:97-106.

8 Cao JL(曹俊嶺).The effect of oil of Fructus Cannabis on the sera，brains'NO and thymus histology of the mice in constipation caused by compound Di Fen Nuo Zhi.J Henan Univ Chin Med(河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2004，19(2):25-26.

9 Zhang K(張琨)，He JF(何錦風(fēng)).Autooxidation and antioxidation ability of hemp seed oil.China Oils Fats(中國油脂)，2008，33:22-26.

10 Maziere C，F(xiàn)loret S，Santus R，et al.Impairment of the EGF signaling pathway by the oxidative stress generated with UVA.Free Radic Biol Med，2003，34:629-636.

11 Chen SY(陳淑映)，Luo DX(羅德祥).Determination of the sun-screening effect for 50% alcohol extracts of 100 Chinese herbal medicine most in use.Int Med Health Guid News(國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào))，2005，11:67-69.

12 Sun T(孫濤)，F(xiàn)u XY(付雪艷).Measurement of the antiradical efficiency of proanthocyanidin in seabuckthorn seed by the DPPH· assay.J Ningxia Med Univ(寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2009，31:26-27.

13 Hu Y(胡躍)，Yan CL(閻春林)，Liao KH(廖康煌).Autooxidation and antioxidation ability of hemp seed oil.Chin J Dermatol(中華皮膚科雜志)，1997，30:377-379.

14 Liao Y(廖艷)，Wang X(王雪)，Zhang LS(張立實(shí))，et al.Study on using heamolysis test as an alternative method of Draize eye irritation test.Mod Prevent Med(現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué))，2002，29:593-595.

15 Su R(蘇銳)，Zhang H(張紅).Study on antioxidant activity of flavonoids from Portulaca oleracea L.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2010，38:4068-4070.

16 Kakegawa H，Matsumoto H，Satoh T.Inhititory effects of some natural products on the activation of hyaluronidase and their anti-allergic actions.Chem Pharm Bull(Japan)，1992，40:1439-1442.

17 Liang H(梁紅)，Pan WM(潘偉明)，Zhang WF(張偉鋒).The extract technique of flavonoid of Ginkgo biloba L.leaves.J Plant Res Environ(植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào))，1999，8(3):12-17.

18 Liu W(劉瑋)，Zhang HL(張懷亮).Skin Science and Cosmetic Efficacy(皮膚科學(xué)與化妝品功效評(píng)價(jià)).Beijing:Chemical Industry Press，2005.53-80.

19 Dong YM(董銀卯).The Cosmetic Formulation Manual(化妝品配方工藝手冊(cè)).Beijing:Chemical Industry Press，2005.