余響華，蔣瓊鳳，邵金華

湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南科技學(xué)院，永州 425100

喜樹(Camptotheca acuminata)又名旱蓮、水栗、水桐樹、旱蓮子、野芭蕉等，屬藍(lán)果樹科(Nyssaceae)、喜樹屬(Camptotheca)，為我國(guó)特有植物，主要分布于長(zhǎng)江以南地區(qū)［1］。喜樹中含有顯著、廣譜抗腫瘤活性［2］的生物堿物質(zhì)-喜樹堿(camptothecin，CPT)，它能夠穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA 裂解復(fù)合物，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素DNA 的雙鏈裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。CPT 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I 發(fā)揮細(xì)胞毒性的天然植物活性成分［4］。由于喜樹堿本身具有較大毒性，不能直接用于臨床治療，較為可行的是以喜樹堿為前體原料，通過合成高效低毒的衍生物以獲得新的抗癌藥物［5］。目前美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)4 種喜樹堿衍生物CPT-11、TPT、9-AC、9-1NC 用于治療結(jié)腸/直腸癌及卵巢癌［6，7］，開發(fā)出的CPT 衍生物已成為繼紫杉醇后的又一類重要抗癌新藥。因此，對(duì)當(dāng)今抗癌新藥的原料藥-喜樹堿的研究仍具有十分重大的現(xiàn)實(shí)意義。

不同地區(qū)喜樹中喜樹堿含量差異性較大，湖南產(chǎn)喜樹果中CPT 在0.9%左右［8，9］。本研究以湖南產(chǎn)喜樹果為原材料，運(yùn)用Design-Expert 7.0 軟件，建立正交實(shí)驗(yàn)組，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析優(yōu)化，建立了喜樹堿乙醇提取的最佳工藝條件，為喜樹堿的規(guī)?；a(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與儀器

喜樹果，2013年11 月采摘自湖南永州，根據(jù)《中國(guó)植物志》的描述，結(jié)合咨詢2 位具有天然植物有效成分(藥用)方面的博士(姜紅宇、劉小文)，鑒定為喜樹果(Camptotheca acuminate fruit)，曬干后4℃低溫貯藏。

喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%，上海純優(yōu)生物，批號(hào):P0281)、甲醇(色譜純)，氯仿、95%乙醇、無(wú)水乙醇、甲醇、NaOH、鹽酸均為AR 級(jí);

主要設(shè)備與儀器:粉碎機(jī)、TG21KR 離心機(jī)、日本島津LC-10ATvP 高效液相色譜儀、Kromstar C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、予華儀器HH-WO 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HASUC DZF-6030 型真空干燥箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

干燥、粉碎→乙醇回流浸提→減壓濃縮得浸膏→氯仿提取→減壓濃縮→甲醇回流提取→過濾，得不溶物→NaOH 溶解→離心，收集濾液→調(diào)酸→加甲醇，保溫析出→抽真空干燥→定容→HPLC 檢測(cè)。

2.2 原料及提取液的處理

2.2.1 原料的前處理

將采集到的喜樹果實(shí)經(jīng)60 ℃低溫干燥，控制水分在5%以下，粉碎過20 目篩，備用。

2.2.2 乙醇浸提流程

準(zhǔn)確稱取20.0 g 喜樹果粉末，按一定的料液比加入乙醇溶液回流浸提，收集浸提液，減壓濃縮得浸膏，加200 mL 氯仿震蕩提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收氯仿，干物質(zhì)經(jīng)200 mL 甲醇回流提取，抽真空過濾，用50 mL 2.5 mol/L 的NaOH 震蕩溶解濾渣部分，6500 rpm 離心5 min，取上清液，2.0 mol/L HCl調(diào)酸至pH 2.0～3.0，加200 mL 的甲醇震蕩析出喜樹堿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃蒸發(fā)至干，加甲醇(色譜級(jí))溶解，定容于100 mL 容量瓶中，備用，HPLC 檢測(cè)。

2.3 喜樹堿含量的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)品溶液配制

精確稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用10 mL 色譜級(jí)甲醇溶解，配成100 mg/L 母液備用。將母液稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.2 HPLC 條件

流動(dòng)相:甲醇∶水(v/v)=60∶40;流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm［10］，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10μL。

2.3.3 樣品喜樹堿含量的測(cè)定

按上述色譜條件，吸取10 μL 樣品溶液，上HPLC 儀檢測(cè)。測(cè)得數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得樣品喜樹堿濃度，喜樹堿含量按下式計(jì)算:

式中，C 為樣品喜樹堿濃度(mg/L)，V 為樣品定容的體積(mL)，M 為稱取樣品質(zhì)量(g)。

2.4 乙醇浸提喜樹堿單因素實(shí)驗(yàn)

設(shè)定其它條件不變的情況下，分別考察液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)喜樹堿得率的影響(表1)。

表1 喜樹堿乙醇提取單因素變化條件Table 1 Condition of single factor experiments for ethanol extraction

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)喜樹堿提取率有顯著影響的3 個(gè)因素:料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間，利用正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合Design-Expert 7.0 軟件分析上述3 個(gè)因索在3 個(gè)水平上對(duì)喜樹堿提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of RSM experiment

圖1 喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of camptothecin standard (A)and sample (B)

3 結(jié)果與分析

3.1 喜樹堿含量測(cè)定

將標(biāo)準(zhǔn)喜樹堿溶液和分離純化后的樣品溶液上HPLC 儀器檢測(cè)，所得圖譜如下:

結(jié)果表明，喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為7.492 min(圖1A);喜樹堿濃度(mg/L)X 與峰面積(uv·s)Y 的線性回歸方程為:Y=16713X -20674，R=0.9994，表明喜樹堿在5.0～40.0 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線形關(guān)系;樣品(圖1B)在7.502 min 處出峰，且與其它組分達(dá)到基線分離，證明提取物中含有喜樹堿。

3.2 乙醇浸提喜樹堿單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對(duì)喜樹堿提取效率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 液料比分別加入80%、85%、90%、95%、100%的乙醇40 ℃浸提2.0 h，經(jīng)純化后測(cè)定喜樹堿濃度，得乙醇濃度與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(A)。結(jié)果表明，提高乙醇濃度有利于喜樹堿的浸出，當(dāng)乙醇濃度超過90%，得率反而降低，100%時(shí)提取效率最低，僅有0.375‰。水的存在有利于喜樹果粉末有效成分的溶出，提高乙醇濃度可增加喜樹堿提取率，在90%時(shí)達(dá)到最大值，因此選擇90 %的乙醇溶液為浸出最優(yōu)濃度。

3.2.2 液料比對(duì)喜樹堿提取的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 的液料比加入90 %的乙醇40 ℃浸提2.0 h，經(jīng)純化后測(cè)定喜樹堿濃度，得料液比與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(B)。結(jié)果顯示，隨著提取溶劑用量的增加，喜樹堿含量也相應(yīng)提高，但增幅隨溶劑用量的增加而減緩，當(dāng)濃縮比超過1∶20 后，喜樹堿的得率保持不變，為節(jié)省溶劑及回收溶劑的能耗，選擇最佳液料比為20∶1。

3.2.3 提取溫度對(duì)喜樹堿提取率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 的液料比加入90%的乙醇，分別于20、30、40、50、60 ℃浸提2.0 h，經(jīng)純化后測(cè)定喜樹堿濃度，得提取溫度與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(C)。

結(jié)果顯示，在20～40 ℃提取范圍內(nèi)，隨著溫度升高，喜樹堿得率緩慢增加，但增勢(shì)不明顯，僅為0.84%;40 ℃至60 ℃時(shí)則基本無(wú)變化，說明在40～60 ℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)提取效率影響不顯著，因此喜樹堿乙醇提取溫度宜控制在40 ℃，后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再考查溫度因素。

3.2.4 提取時(shí)間對(duì)喜樹堿提取率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 液料比加入90%的乙醇，40 ℃下分別浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，經(jīng)純化后測(cè)定喜樹堿濃度，得提取時(shí)間與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(D)。

由圖可知，浸提時(shí)間對(duì)喜樹堿的得率有較大影響，提取時(shí)間越長(zhǎng)，喜樹堿得率越高。考慮到提取時(shí)間過長(zhǎng)將延長(zhǎng)提取周期，且會(huì)增加喜樹堿發(fā)生氧化概率，進(jìn)而降低喜樹堿提取效率，因此選擇浸提時(shí)間2.0 h 為宜。

圖2 乙醇濃度(A)、液料比(B)、溫度(C)及時(shí)間(D)對(duì)喜樹堿提取效率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration (A)，liquid:solid ratio (B)，temperature (C)and time (D)on the extraction yield of camptothecin

3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)影響提取得率較大的液料比、乙醇濃度、提取時(shí)間3 因素作3 水平的響應(yīng)面正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of RSM experiments

3.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，所得方差分析如表4 所示。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 ANOVA of regresion models

利用Design-Expert 7.0 對(duì)表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到生物堿提取率(Y)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為:Y=-12.2613+0.26399A+6.795 × 10-3B +1.20095C+1.7 ×10-4AB-5.9 ×10-3AC-3.2 ×10-3BC-1.438 × 10-3A2-3.48 × 10-4B2-0.1368C2，R2=0.9998，表明擬合情況良好，回歸方程模型可行。

方差分析結(jié)果表明，各因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著:回歸模型F 值=87.72，P＜0.0001，表明二次多元回歸模型極其顯著;失擬F 值=4.72，P=0.0839＞0.05，模擬失擬不顯著;模擬的整確定系數(shù)R2=0.9998，說明該模型擬合程度比較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，適合用于對(duì)喜樹生物堿提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

圖3 3 因素交互作用對(duì)喜樹堿提取率影響的響應(yīng)面圖(B-C、A-C、A-B)Fig.3 Response surface plots showing the cross interaction among three factors (BC，AC，AB)

圖4 分別表示在固定乙醇濃度90%、液料比20∶1(mL/g)和醇提時(shí)間2.0 h 的條件下，液料比-時(shí)間(B-C)、液料比-時(shí)間(A-C)、乙醇濃度-液料比(AB)3 因素交互作用對(duì)提取率的影響。結(jié)果顯示，A、B、C 三者交互作用顯著。對(duì)回歸方程進(jìn)行一階求導(dǎo)，得3 元一次方程:0.26399-0.00017B-0.0059C-0.002874A=0;0.006795-0.00017A-0.0032C-0.00696B=0;1.20095-0.0059A-0.0032B-0.2736C=0。求解方程得到最佳提取條件為:乙醇濃度88.53%，液料比21.4∶1(mL/g)，時(shí)間2.23 h，按照上述條件補(bǔ)做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示喜樹堿提取率提高至0.847 mg/g(干重)，較單因素最佳提取工藝提高了3.42%，優(yōu)化效果顯著。

4 結(jié)論

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)喜樹生物堿3 個(gè)影響因素進(jìn)行分析，確定最佳提取工藝為乙醇濃度88.53%，液料比21.4∶1(mL/g)，時(shí)間2.23 h，此時(shí)喜樹生物堿提取率可達(dá)到0.847 mg/g(干重)。本研究首次采用響應(yīng)面正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)湖南產(chǎn)喜樹生物堿提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。本研究為實(shí)現(xiàn)喜樹中特殊成分-喜樹堿提取效率的提高，進(jìn)一步開發(fā)利用喜樹這一重要藥用植物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為喜樹堿的提取工藝提供了又一科學(xué)合理，準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 Zhao JL(趙金良)，Tang XD(唐曉丹)，Yun D(運(yùn)達(dá))，et al.Optimization of extraction process of camptothecin and 10-hydrxycamptothecin by orthogonal design.J Anhui Agric(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2012，40:9655-9656.

2 Liu LF，Desai SD，Li TK，et al.Mechanism of action of camptothecin.Ann NY Acad Sci，2000，922:1-10.

3 Mross K，Richly H，Schleucher N，et al.A phase I clinical and pharmacokinetic study of the camptothecin glycoconjugate，BAY 38-3441，as a daily infusion in patients with advanced solid tumors.Ann Oncol，2004，15:1284-1294.

4 Hsiang YH，Liu LF，Wall ME，et al.DNA topoisomeraseⅠ-mediated DNA cleavage and cytotoxicity of camptothecin analogues.Cancer Res，1989，49:4385-4389.

5 Giovanella BC.TopoismeraseⅠInhibitors.Cancer therapeu-tics:experimental and clinical agents (B.Teicher Humana eds.)，1997，137-151.

6 Wang Y(王洋)，Yu T(于濤)，Zhang YH(張玉紅)，et al.Study on extraction of camptothcin by NaOH AQ.From fruits of Camptotheca acuminata.Bull Bot Res (木本植物研究)，2000，20:433-437.

7 Lorence A，Nessler CL.Camptothecin，over four decades of surprising findings.Phytochem，2004，65:2735-2749.

8 Zhang YH(張玉紅).The geographical variation and seasonal changes of camptothecin in fruits of Camptotheca acuminata.J Nor East Forest Univ(東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2002，30(6):44-46.

9 Wang LL(王玲麗)，Liu WZ(劉文哲).Contents of camptothecin in Camptotheca acuminata from different provenances.Chin Bull Bot (植物學(xué)通報(bào))，2005，22:584-589.

10 Zhang YH(張玉紅)，Zu YG(祖元?jiǎng)?.Study on camptothecin content in leaves of Camptotheca acuminata from different regions and season.Chin Bull Bot (植物學(xué)通報(bào))，2003，20:572-575.