杭 偉，張欽德，王 曉，林昌虎，段文娟*

1山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 250355;2山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，煙臺 264000;3山東省科學院山東省分析測試中心，濟南 250014;4 貴州省理化測試分析研究中心 貴州省科學院，貴陽 550002

桂枝為樟科樟屬植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝，主產于廣西、廣東、云南［1］。桂枝具有解表散寒、溫經通脈、化氣行水等，《傷寒論》和《金匱要略》中多處使用桂枝組方［2］。臨床上主要用于治療風濕痹痛、小便不利、濕阻、脅痛等［3］。桂枝中主要成分是桂皮酸、桂皮醛、香豆素類等化合物，現代研究表明此類化合物是桂枝發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)靜、平喘、抗過敏等作用的主要藥效物質基礎。但是，此類化合物的穩(wěn)定性較差，在高溫、光照等條件下容易發(fā)生變化，采用常規(guī)色譜方法很難得到大量高純度化合物。因此，研究建立相關成分快速高效的分離純化方法對其活性研究具有重要意義。.

高速逆流色譜法(high-speed counter-current chromatography，簡稱HSCCC)是一種不需要固態(tài)載體的液-液分配色譜技術，具有操作簡便、可避免因不可逆吸附而引起的樣品損失等優(yōu)點，已被廣泛應用于天然產物的分離純化中［4，5］。本研究將高速逆流色譜技術應用于桂枝化學成分的研究，但是前期研究發(fā)現僅使用高速逆流色譜很難一次性得到單體化合物，因此，采用高速逆流色譜結合制備高效液相色譜的方法進行分離純化，共得到4 種純度大于95%的化合物，采用核磁共振波譜法鑒定了其化學結構。實現了對桂枝中化學成分快速、有效的分離純化，為桂枝資源的進一步開發(fā)應用提供了技術和物質支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

GS10A 型高速逆流色譜儀(北京艾美林科技有限公司)、TBP 泵(上海同田生物技術有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3mm，分離體積230 mL，β 值為0.5～0.8)、8823B-紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限司)、3057-11 記錄儀(重慶川儀總廠有限公司);Waters 600-996 高效液相色譜系統(配有光電二極管陣列檢測器(PDA)，美國Waters公司);Varian INOVA-600 核磁共振波譜儀(美國Varian 公司);Agilent 1100 Series 6320 ion-trap 質譜儀(美國Agilent 公司)。

實驗用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和甲醇均為分析純(天津市廣成化學試劑有限公司)，所用水為蒸餾水;液相色譜用甲醇為色譜純(美國天地公司)，所用水為純凈水;桂枝藥材購自山東中醫(yī)藥大學中魯醫(yī)院，經山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為樟科樟屬植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝。

1.2 桂枝粗提物制備

桂枝藥材10 Kg 粉碎后用95%的乙醇溶液滲濾提取，提取液減壓濃縮后用水混懸，然后分別用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取三次，合并濾液，正丁醇部分減壓濃縮，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HSCCC 分離

1.3.1 兩相體系的配制

兩相溶劑體系及樣品溶液的制備，本實驗選擇溶劑系統為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶6∶4，v/v)，配制約1500 mL，置于分液漏斗中，劇烈振蕩使其充分混合后靜置分層，平衡后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動相，分別超聲脫氣10 min，備用。

稱取桂枝正丁醇相樣品170 mg，加入上下相各4 mL，振蕩使其完全溶解，備用。

1.3.2 HSCCC 分離制備過程

將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20 mL/min 的流速泵入HSCCC 分離管中，待上相充滿整個分離管后，調節(jié)主機轉速達850 rpm，順時針旋轉，待轉速穩(wěn)定后，以2.0 mL/min 流速泵入下相(流動相)，檢測波長為254 nm。當流動相從主機口流出時，說明體系已達到流體動力學平衡，此時將已準備好的8mL 樣品注入HSCCC 儀，同時開始采集數據，根據色譜圖收集目標成分。

1.3.3 分配系數(KD)的測定

根據文獻報道的KD值測定方法［6］，取桂枝正丁醇相樣品置于10 mL 試管中，加入上下相各2 mL，劇烈振蕩1 min，使樣品充分溶解，靜置分層，取上下相各5 μL，用HPLC 分別進行檢測，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，KD=A1/A2。

1.4 制備高效液相分離

1.4.1 Pre-HPLC 分離制備過程

將HSCCC 分離出的餾分濃縮至干，用少量甲醇溶解，過0.45 μm 濾膜，采用高效液相色譜進行制備分離，用60%甲醇等度洗脫，流速3.0 mL/min，檢測波長247 nm.根據峰形分別收集流出液，流出液減壓濃縮干。

1.4.2 HPLC 條件

色譜柱:Inertsil ODS-SP 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫:25 ℃。流動相A:甲醇;流動相B:純凈水溶液;線性梯度洗脫程序:0～25min，30%A～100%A;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:247 nm。采用此條件對桂枝正丁醇相總樣及逆流所得餾分進行分析。

1.4.3 Pre-HPLC 條件

色譜柱:YMC-pack ODS-A 柱(250 mm × 10 mm，5 μm)，柱溫:25 ℃。流動相:甲醇-水(60∶40)，流速:3.0 mL/min;進樣量:50 μL;檢測波長:247 nm。采用此條件對桂枝正丁醇相逆流所得餾分進行分離。

2 結果與討論

2.1 HSCCC 分離條件的優(yōu)化

在高速逆流色譜法的分離應用中，溶劑體系的選擇是分離中的首要和關鍵環(huán)節(jié)，溶劑體系是否合適是由目標化合物在其中的分配系數KD來衡量的，適宜的溶劑系統對于目標化合物來說分配系數應在0.5～2 之間。本實驗根據目標化合物的極性采用對石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系，因為這四相體系具有較寬的極性范圍以及良好的溶解度。如表1 所示，選擇了幾種不同的溶劑系統，進行K 值測量。當采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶8∶2 及8∶2∶7∶3，v/v)為兩項溶劑系統時，KD值較小，如果采用這兩種溶劑系統會導致分離時間太短，達不到良好的分離效果，難以實現目標化合物的分離純化。采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶5∶5，v/v)的體系時，KD值偏大，雖然取得了很好的分離效果，但是分離時間較長，也不利于快速高效的分離。實驗結果表明，只有當采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶5∶5，v/v)體系時，目標化合物可得到較理想的分離效果且分離時間較短。

表1 兩種餾分在不同溶劑系統中的分配系數Table 1 KDof two fractions in different solvent system

2.2 HSCCC 分離純化結果

選用溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶6∶4，v/v)按照1.3 節(jié)所述的方法對桂枝樣品進行HSCCC 分離，根據HSCCC 譜圖分段收集，分離結果如圖1 所示，經HPLC 檢測，峰1 為化合物1 和化合物2 混和物，峰2 為化合物3 和化合物4 混和物。所以本文采用Pre-HPLC 的方法繼續(xù)分離純化目標化合物。

圖1 桂枝正丁醇相高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC figure of Cinnamomum cassia Presl in n-butonal phase

2.3 Pre-HPLC 分離純化結果

將HSCCC 分離出的餾分1 和餾分2 分別濃縮至干，用少量甲醇溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，采用制備型高效液相色譜進行分離，用60%甲醇/水等度洗脫，流速3 mL/min，檢測波長247 nm。根據峰形分別收集流出液，流出液減壓濃縮干燥.分別得到化合物1，化合物2，化合物3 化合物4。制備后化合物1、2、3、4 的純度均達到95%以上。圖2 為餾分1和2 的制備液相圖。

圖2 餾分1 和2 的制備液相圖(A:為餾分1 制備液相圖;B:餾分2 的制備液相圖)Fig.2 HPLC figures of fraction 1 and 2(A:HPLC figure of fraction 1，B:HPLC figure of fraction 2)

2.4 HPLC 分離條件的優(yōu)化

分別考察了，甲醇-水、乙腈-水溶液作為流動相時各組分的分離情況，結果表明當流動相A 為甲醇，流動相B 為水溶液的時候，化合物得到很好的分離，所以本實驗選用甲醇-水作為流動相。

3 結構鑒定

化合物1 白色針晶(甲醇)。1H NMR (600 MHz，CDCl3)δ:8.02(1H，d，J=9.6Hz，H-4)、7.73(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)、7.61(1H，td，J=7.8，1.8 Hz，H-6)、7.37 (1H，d，J=7.2 Hz，H-5)、7.35(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)、6.44(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)。以上波譜數據與文獻［7］對照基本一致，故鑒定化合物1 為香豆素。

圖3 桂枝正丁醇相總樣及各化合物的HPLC 譜圖Fig.3 HPLC figures of total sample and each components from Cinnamomum cassia Presl in n-butanol phase

化合物2 白色無定型粉末(甲醇)。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.96(1H，d，J=15.6 H z，H-7)、7.57 (1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6)、7.35(1H，td，J=7.2，1.8 Hz，H-4)、7.02(1H，d，J=7.8 Hz，H-3)、6.97(1H，td，J=7.8 Hz，H-5)、6.50(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)、3.89 (3H，s，OCH3)。13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:171.1 (-COOH)、159.9(C-2)、141.4 (C-7)、132.7 (C-4)、129.6 (C-6)、124.2(C-1)、121.8 (C-8)、119.4 (C-5)、112.3(C-3)、56.2(OCH3)。以上波譜數據與文獻［8］對照基本一致，故鑒定化合物2 為反式-鄰甲氧基桂皮酸。

化合物3 油狀物，1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:7.66 (1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，7.59(2H，m，H-2，6)，7.41 (1H，m，H-4)，7.39 (2H，m，H-3，5)，6.48 (1H，d，J=16.2 Hz，H-8)。13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ:169.9(CO)，145.2(C-7)，134.6(C-1)，130.4(C-4)128.8 (C-3，5)，128.2 (C-2，6)，118.4(C-8)。以上數據與文獻［9］中報道的桂皮酸基本一致，確定化合物3 為桂皮酸。

化合物4 淡黃色液體，1H NMR (600 MHZ，CDCl3)δ:7.57～7.62 (2H，m)，6.74 (dd，反式雙鍵，H-2)，9.71 (CHO)。13C NMR (150 MHZ，CDCl3)δ:133.2～133.9(C-4～9)，100.0，157.9(C-2，3)，198.8(CHO)。以上理化性質及波譜數據與文獻［10］報道基本一致，確定化合物4 為反式桂皮醛。

1 Drug administration of the people's Republic of China Ministry of health(中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局)，The national institute for the control of pharmaceutical and biological products.Handbook of Chinese medicinal materials(中藥材手冊).Beijing:People's Medical Publishing House，1989.6022.

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