周文杰，楊 建，張瑞娟，萬 茵，韓 蓓*

1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院;2 陜西省營(yíng)養(yǎng)與食品安全工程研究中心，西安 710061;3南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330047

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生長(zhǎng)條件寬泛，在寬譜的pH 和溫度范圍內(nèi)都能很好的生長(zhǎng)，具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。目前的研究表明解淀粉芽孢桿菌具有廣譜的抑菌活性，包括細(xì)菌和真菌，其主要的抑菌成分是抑菌蛋白［2］，也有抑菌成分為肽脂類、聚酮化合物［3-5］等的報(bào)道，以往有的研究以蛋白酶處理的方法證明其抑菌成分的多肽性質(zhì)，而蛋白酶處理不能使其抑菌活性完全喪失［6］，也有一些研究嘗試提取抑菌成分后鑒定其化學(xué)成分，但由于所用不同的分離株［2，7］，因此不能排除其它性質(zhì)抑菌成分存在的可能。

本實(shí)驗(yàn)室從即食水果果盤上分離出一株解淀粉芽孢桿菌，命名為C-1，其在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量的胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)，該菌現(xiàn)保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中(編號(hào)M 2012177)。胞外多糖是細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由細(xì)菌分泌到胞外并溶解于環(huán)境的水中，由于其分子致密交聯(lián)的原因，可以在細(xì)菌周圍形成屏障阻礙細(xì)菌同環(huán)境的物質(zhì)能量交換，從而保護(hù)細(xì)菌免受毒物、噬菌體、高滲透壓、高溫、pH 等惡劣環(huán)境的影響［8-10］，但同時(shí)也可能因此而阻礙其他細(xì)菌對(duì)于環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，具體機(jī)制仍是目前國(guó)內(nèi)外的一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)胞外多糖還有很多的生物活性，比如抗氧化、抗輻射、降血糖、刺激免疫、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等［11-13］，因而胞外多糖在生物膜制造，醫(yī)藥保健品開發(fā)方面具有很大的潛力［14，15］。

食源性致病菌是導(dǎo)致微生物性食物中毒的一類病原菌，根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心《衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于2012年全國(guó)食物中毒事件情況的通報(bào)》的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù):微生物性食物中毒事件中毒人數(shù)最多，占總數(shù)的56.1%。與2011年相比，報(bào)告起數(shù)和中毒人數(shù)分別減少28.2%和27.0%，但死亡人數(shù)增加2 人;主要是由沙門氏菌(Salmonellaspp.)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris)、志賀氏菌(Shigellaspp.)、椰毒假單胞菌(Psedomonascocovenenans)等引起的細(xì)菌性食物中毒［16］。對(duì)食源性致病菌的控制是食品工業(yè)防腐方向的一個(gè)重點(diǎn)，針對(duì)食源性致病菌的高效生物防腐劑研究成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)基于解淀粉芽孢桿菌的抑菌活性和C-1高產(chǎn)量的胞外多糖的性質(zhì)，初步推測(cè)其胞外多糖可能為其抑菌成分之一。通過生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)驗(yàn)證了C-1 發(fā)酵液對(duì)9 株高致病率的食源性致病菌的抑菌活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)黑色素具有明顯的抑制作用，之后提純其胞外多糖，并通過平板抑菌活性實(shí)驗(yàn)，證明不具有顯著的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)以Bacillus amyloliquefaciensC-1(本實(shí)驗(yàn)室自行分離保藏)為生產(chǎn)菌株。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereusMS10362R)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)為中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所袁志明研究員惠贈(zèng);梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficileQB21)和金黃色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusS251)為本實(shí)驗(yàn)室自行分離保藏;福氏痢疾桿菌(ShigellaflexneriCDC1)和宋內(nèi)痢疾桿菌(ShigellasonneiCDC2)來源于西安市疾控中心;大腸桿菌(E.coliATCC25922，本實(shí)驗(yàn)室保存菌株)，這7 株細(xì)菌為抑菌試驗(yàn)的檢測(cè)菌株。

液體培養(yǎng)基采用LB 培養(yǎng)基，配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L;固體平板采用LB固體培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基RCM(強(qiáng)化梭菌厭氧培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司);LB 固體培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉5 g/L，瓊脂1.5%。除厭氧梭菌需在厭氧培養(yǎng)箱(Coy，Ann Arbor，MI，USA)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，其余細(xì)菌均無特殊要求，通氣培養(yǎng)。

1.2 試劑

考馬斯亮藍(lán)G250 染料、Whatman4057050、Tris、EDTA、濃硫酸，1.0 mol/L NaCl、95%乙醇、0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、Sevage 試劑:(氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V)等試劑均為分析純。

1.3 B.amyloliquefaciensC-1 發(fā)酵液提取

接種環(huán)取C-1 單菌落至3 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 rpm 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜;次日按1%量轉(zhuǎn)接至50 mL LB 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 rpm 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5 h，按1%量轉(zhuǎn)接至多份150 mL LB 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 rpm 恒溫箱中培養(yǎng)96 h。4 ℃，10000 rpm 離心取上清液，分為兩份，一份4 ℃下留置作為全發(fā)酵液上清(測(cè)定該上清的EPS 濃度)，一份用于提取胞外多糖。

1.4 C-1 發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)

1.4.1 平板法抑菌試驗(yàn)

在直徑約15 cm 平板傾倒固體培養(yǎng)基厚約6 mm，冷卻后均勻打孔5 個(gè)，孔徑6 mm，其中包含陽性對(duì)照孔一個(gè)(敏感抗生素)，陰性對(duì)照孔一個(gè)(等體積的LB 液體培養(yǎng)基)，實(shí)驗(yàn)組孔3 個(gè)，分別加入100 μL C-1 全發(fā)酵上清液(其EPS 濃度為1.0 mg/mL)，抑菌活性以抑菌圈直徑表示。

1.4.2 生長(zhǎng)曲線法抑菌試驗(yàn)

通過上述實(shí)驗(yàn)選擇1～2 株對(duì)上清液敏感的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為高劑量組、低劑量組、對(duì)照組三組，均為培養(yǎng)基150 mL，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別加入上清液4 mL、0.6 mL、0 mL 并用培養(yǎng)基補(bǔ)足使三者液體總量一致。最適宜溫度下(芽胞桿菌30 ℃，其余細(xì)菌為37 ℃)，200 rpm 下培養(yǎng)，每2～3 h 取樣用全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Tecan，Infinite 200)測(cè)量OD600，并繪制生長(zhǎng)曲線圖，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)。

1.5 C-1 胞外多糖提取

將1.4 中上清液按照1∶3 比例加入無水乙醇，4℃下過夜沉淀多糖，次日4 ℃離心收集多糖，并用Sevage 試劑充分出去雜蛋白，離心，取上層EPS 溶液。用滅菌去離子水透析60 h，然后用聚乙二醇將透析過的胞外多糖濃縮，其間每3 h 用苯酚-硫酸法測(cè)EPS 的濃度直到其濃度≥C-1 全發(fā)酵上清液內(nèi)EPS 濃度為止。將收集到的EPS 溶液4 ℃下保存待用。

用考馬斯亮藍(lán)G250 處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，得到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并最終得到粗胞外多糖中蛋白質(zhì)含量定量測(cè)定結(jié)果。

1.6 C-1 胞外多糖抑菌試驗(yàn)

平板及分組情況同1.4.1，差別僅為實(shí)驗(yàn)組加入100 μL EPS 濃度為1.0 mg/mL 的C-1 胞外多糖液，抑菌活性同樣以抑菌圈直徑表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 C-1 全發(fā)酵液上清抑菌活性

2.1.1 C-1 發(fā)酵液上清的平板抑菌試驗(yàn)

根據(jù)1.4.1 的設(shè)計(jì)進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn)，得到如表1 的抑菌結(jié)果。陽性對(duì)照為敏感抗生素，濃度為25 μg/mL，陰性對(duì)照為滅菌蒸餾水，上清液和胞外多糖液含胞外多糖濃度均為1.0 mg/mL，加樣量均為100 μL。

表1 C-1 上清液的平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 1 Result of antimicrobial activity of C-1supernatant (n=3)

由該表數(shù)據(jù)得知，C-1 上清液對(duì)蠟樣芽孢桿菌MS10362R，梭狀芽孢桿菌QB21，大腸桿菌ATCC 25922 的抑菌效果比較顯著。

2.1.2B.cereusMS10362R 在C-1 發(fā)酵液作用下的生長(zhǎng)曲線

圖1 B.cereus MS10362R 在C-1 上清液抑制作用下的生長(zhǎng)曲線圖Fig.1 Growth curve of B.cereus MS10362R treated by C-1 supernatant

選取上述敏感菌株蠟樣芽孢桿菌MS10362R 進(jìn)行生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)。分為高劑量、低劑量和對(duì)照組三組，均為培養(yǎng)基150 mL，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別加入上清液4、0.6、0 mL 并用培養(yǎng)基補(bǔ)足使三者液體總量一致，結(jié)果如圖1。

圖1 中對(duì)照組和低劑量組曲線基本重合，在接種2 h 后即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而高劑量組則在接種10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，表明高劑量B.amyloliquefaciensC-1發(fā)酵上清液對(duì)于該細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，三組在對(duì)數(shù)期曲線斜率沒有明顯差異。由于三組差異在適應(yīng)期，需排除因C-1 發(fā)酵上清液量不一致導(dǎo)致的物理因素影響，三組唯一可能差別為pH。為了排除由于 C-1 發(fā)酵上清液的引入導(dǎo)致B.cereusMS10362R 培養(yǎng)基起始pH 的差異而出現(xiàn)的生長(zhǎng)受抑制的情況，對(duì)接種前，加入不同體積C-1 發(fā)酵上清液后的三組培養(yǎng)基的pH 做了測(cè)定，結(jié)果如表1。

表2 C-1 發(fā)酵液上清加入后對(duì)B.cereus MS10362R 培養(yǎng)基起始pH 的改變Table 2 pH variation of B.cereus MS10362R culture medium with addition of C-1supernatant

表2 中三組培養(yǎng)基的pH 差別不明顯，高劑量組和低劑量組的起始pH 非常接近，對(duì)照組與其他兩組略有差別，因此若以pH 差異為由解釋圖1 明顯不合理，固可排除pH 等物理因素的影響，確認(rèn)C-1 發(fā)酵上清液中確實(shí)存在某種具有抑菌活性的物質(zhì)。

生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)C-1 發(fā)酵上清液對(duì)于蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)黑色素具有明顯的抑制作用。如圖2。

圖2 蠟樣芽胞桿菌MS10362R 在C-1 發(fā)酵上清液作用下的黑色素產(chǎn)量變化Fig.2 The melanin production of B.cereusMS10362Rtreated byC-1supernatant

可見在84 h 時(shí)對(duì)照組顏色深、產(chǎn)色素量大，明顯區(qū)別于低劑量和高劑量組，后兩者顏色相差不大產(chǎn)黑色素量基本一致，直到120 h，三組產(chǎn)黑色素量才基本相等。同時(shí)在B.cereusMS10362R 培養(yǎng)至48 h 以后各組間的細(xì)胞數(shù)(OD600)基本一致，所以黑色素的產(chǎn)量差異與細(xì)胞數(shù)量無關(guān)聯(lián)。

2.2 C-1 胞外多糖抑菌活性

表2 結(jié)果顯示C-1 粗提胞外多糖對(duì)于所用9 株受試菌均不敏感，可以初步確定單純的胞外多糖液(EPS 液)不具有抑菌活性。

表2 C-1 上清液及胞外多糖的平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Result of antimicrobial activity of C-1supernatant and EPS (n=3)

3 討論和展望

解淀粉芽孢桿菌分布廣泛，菌種資源豐富，培養(yǎng)較簡(jiǎn)單，在較寬譜的pH 和溫度范圍內(nèi)都能很好的生長(zhǎng)，且代謝產(chǎn)物種類繁多，具有廣泛的細(xì)菌真菌抑菌活性，但由于分離株眾多，抑菌譜不一，發(fā)酵效率一般，某些代謝產(chǎn)物低毒性［17］(尚無致病性報(bào)道)等原因，在生產(chǎn)生活實(shí)踐中還沒有得到廣泛的應(yīng)用，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵效率，毒性產(chǎn)物與抑菌活性等能得到很好的調(diào)和，其在生物防治方面的應(yīng)用可行性將得到很好的提升。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100 μL 解淀粉芽孢桿菌C-1 發(fā)酵液能抑制蠟樣芽孢桿菌MS10362R，梭狀芽孢桿菌QB21，大腸桿菌ATCC 25922 的生長(zhǎng)，與100 μL 25 μg/mL 的相應(yīng)敏感抗生素陽性對(duì)照比較，其抑菌效率可 達(dá) 到 50%～60% (表 1)。對(duì)B.cereusMS10362R 來講，4 mL 的解淀粉芽孢桿菌C-1 發(fā)酵液可以顯著的延長(zhǎng)其生長(zhǎng)遲緩期，將MS10362R 到達(dá)對(duì)數(shù)期的時(shí)間由原來的2 h 推遲至10 h(圖1)，如果將該物質(zhì)分離用于食品防腐劑上，可以在一定程度上延長(zhǎng)食品貨架期;同時(shí)結(jié)果顯示C-1 上清液可以抑制B.cereusMS10362R 黑色素的產(chǎn)生。由于細(xì)菌色素屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，往往在細(xì)菌細(xì)胞密度達(dá)到一定時(shí)才產(chǎn)生，提示C-1 發(fā)酵液抑制B.cereusMS10362R 黑色素產(chǎn)生可能與阻礙細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)和自誘導(dǎo)物質(zhì)(auto-inducer，AI)有一定的關(guān)系［18］。初步推斷C-1 發(fā)酵液抑制色素產(chǎn)生可能與抑制AI 釋放有關(guān)。那么C-1 發(fā)酵液是否能通過同樣的機(jī)制抑制毒素等其他細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生呢?目前還沒有相關(guān)的報(bào)道，這對(duì)于新型抗生素靶點(diǎn)的研究開發(fā)具有顯著地意義。比如對(duì)于甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MARS)感染的患者，病人膿毒血癥十分嚴(yán)重，由于耐藥，沒有抗生素能殺滅細(xì)菌，但是如果能通過抑制AI 的產(chǎn)生及其濃度，或許可以抑制細(xì)菌毒素釋放，病人的癥狀必將得到緩解，細(xì)菌也因?yàn)椴荒墚a(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物而抑制自身的生長(zhǎng)繁殖［19］。

本實(shí)驗(yàn)證明從解淀粉芽孢桿菌C-1 發(fā)酵液上清中分離出的胞外多糖不具有抑菌效果，因此可以初步確定發(fā)酵液上清中具有抑菌活性的物質(zhì)可能是蛋白類或多肽類等物質(zhì)，仍需要進(jìn)一步分離，并進(jìn)行功能研究。

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