瞿曉晶，彭芳芳，尹楹富，譚瑩瑩，權(quán)春善

大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大連 116600

構(gòu)樹［Broussonetia papyrifer(L.)Vent.］為桑科直立落葉喬木，分布在我國華北、西北、華東、中南、西南及遼寧［1］，多為野生，長于山坡、溝邊，有少量栽培。構(gòu)樹果可生食，亦可釀酒，有補(bǔ)腎、壯筋骨、健胃消腫之功效，構(gòu)樹皮、白色汁液均可入藥。臨床上用于治療腰膝酸軟、虛勞骨蒸、頭暈?zāi)炕琛⒛可?、水腫脹滿，還可以治療頑癬、神經(jīng)性皮炎、濕疹等皮膚病［2］。《名醫(yī)別錄》載為上品:甘、寒、無毒。古本草多記載楮實(shí)子(構(gòu)樹果實(shí))為補(bǔ)益藥，功用大補(bǔ)益，久服不饑、不老，輕身［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明:構(gòu)樹果實(shí)具有促進(jìn)記憶、調(diào)節(jié)免疫，降血脂，抗氧化作用，且對(duì)肝病、腎病、眼病、男女不孕不育癥等疾病都有一定的療效，具有很好的藥用價(jià)值，可以被用于生產(chǎn)藥物或保健品。

超聲波提取法是一種新的分離提取技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于油脂工業(yè)，具有操作簡(jiǎn)便快捷、提取溫度低、提取物的結(jié)構(gòu)不被破壞等優(yōu)點(diǎn)［4］，目前，超聲波技術(shù)已經(jīng)嘗試用于八角油、扁桃油、玉米胚芽油、松籽油、蘋果籽油、西瓜籽油、辣椒籽油、獼猴桃籽油的提取中。利用高強(qiáng)度、高頻率聲波及其與物質(zhì)之間相互作用，不但可以破碎植物細(xì)胞壁，使被提取物質(zhì)更易釋放出來，且還可加速溶劑從連續(xù)相到植物細(xì)胞過程。本文利用超聲波法考察了各種因素對(duì)構(gòu)樹種子油提取率的影響，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行了初步研究，為構(gòu)樹的綜合利用奠定了基礎(chǔ)。

同時(shí)，已有研究表明自由基與衰老、癌癥、心血管疾病及炎癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系［5］，而超氧陰離子的過量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA 損壞，破壞人類機(jī)體功能。為進(jìn)一步研究構(gòu)樹種子油的功效，拓展其應(yīng)用市場(chǎng)，本文通過測(cè)定構(gòu)樹種子油對(duì)自由基的清除能力以及對(duì)超氧陰離子的抑制作用，較為詳細(xì)的研究了構(gòu)樹種子油的抗氧化能力。為構(gòu)樹種子油在醫(yī)藥、食品、化妝品方面的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

構(gòu)樹種子于2010年和2011年7月至9月采與大連民族學(xué)院校內(nèi)。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲細(xì)胞破碎儀(VCX130PB，USA);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-200，Switzerland);離心機(jī)(NAPCO 2080R，F(xiàn)rench);分光光度計(jì)(Ultrospec 4300pro，Amersham Biosciences);其他均為常規(guī)儀器。

1.3 試劑

丙酮、無水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、鹽酸、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)，以上試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 最佳溶劑篩選

分別以無水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷為提取溶劑。通過比較七種溶劑提取效果和溶劑物化性質(zhì)，篩選出提取構(gòu)樹種子油最佳溶劑。

2.2 構(gòu)樹種子油的提取

影響構(gòu)樹種子油提取率的因素主要有三個(gè):超聲波強(qiáng)度、超聲作用時(shí)間和料液比(g/mL)。首先，將構(gòu)樹種子用研缽研碎，然后稱取質(zhì)量，每個(gè)試管中裝取1 g。最后，參照以下步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 超聲波強(qiáng)度對(duì)構(gòu)樹種子油提取率的影響

在相同的作用時(shí)間5 min 和料液比1 ∶10(g/mL)條件下，用不同的超聲波強(qiáng)度0%、20%、40%、60%、80%、100%分別處理構(gòu)樹種子，離心，將溶劑倒入圓底蒸餾燒瓶中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸出。稱量提取出的種子油的質(zhì)量并按照如下公式計(jì)算提取率。

2.2.2 料液比對(duì)構(gòu)樹種子油提取率的影響

保持一定的作用時(shí)間(5 min)和超聲強(qiáng)度(60%)，在料液比(g/mL)分別為1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1∶10、1∶14、1∶16 的情況下，對(duì)構(gòu)樹種子油提取率進(jìn)行測(cè)定。

2.2.3 超聲作用時(shí)間對(duì)構(gòu)樹種子油提取率的影響

在超聲強(qiáng)度(60%)和料液比(1∶10)條件不變的情況下，改變作用時(shí)間，時(shí)間(min)分別設(shè)定為2、4、6、8、10、12、14，對(duì)提取率進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

以影響構(gòu)樹種子油提取率的超聲波強(qiáng)度、作用時(shí)間、料液比為考察因素，各因素取三個(gè)水平，探求超聲波強(qiáng)化提取構(gòu)樹種子油的最佳工藝。

2.3 構(gòu)樹種子油抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 有機(jī)自由基(DPPH) 的清除能力

吸取10mL 6.5 ×10-4mol/L DPPH 溶液100 mL容量瓶中定容，搖勻，室溫下避光靜置30 min。分別量取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL 的構(gòu)樹種子油，用丙酮溶解并定容至10 mL，配制成體積比不同的樣品，編號(hào)分別為1、2、3，在517 nm 處測(cè)定溶液的吸光值，通過下式計(jì)算對(duì)DPPH 的清除率:

式中:A0為2 mL DPPH 溶液+2 mL 丙酮;Ai為2 mL DPPH 溶液+2 mL 樣品;Aj為2 mL 樣品+2 mL 丙酮。每個(gè)濃度的樣品重復(fù)三次，計(jì)算平均值［6］。

鄰苯三酚在堿性條件(pH 8.2)下發(fā)生自身氧化反應(yīng)，釋放超氧陰離子自由基，生成有色中間產(chǎn)物并不斷積累，此反應(yīng)導(dǎo)致吸光度在波長320 nm 處形成線性積累。若加入超氧陰離子自由基清除劑，吸光度會(huì)發(fā)生改變。按照配方將樣品與鄰苯三酚溶液混合，測(cè)定其吸光度隨時(shí)間的變化值，并計(jì)算出變化率，將此變化率與對(duì)照溶液變化率相比較便可得出構(gòu)樹種子油對(duì)的清除能力［7］。

樣品制備:分別量取40、60、70、80、100 μL 的構(gòu)樹種子油，用無水乙醇定容至10 mL，配制成不同體積比的樣品。

分別將50 mmol/L Tris-HCl 溶液，30 mol/L 鄰苯三酚溶液和無水乙醇在25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，以50 mmol/L Tris-HCl 溶液調(diào)零，然后按表1 順序迅速加入反應(yīng)液。

表1 試劑的加入量及順序(mL)Table 1 Quantity and adding order of reagents (mL)

依次添加完試劑后迅速搖勻，在波長320 nm 處測(cè)定吸光度，每隔30 s 記錄一次吸光度，在線性范圍內(nèi)連續(xù)記錄10 min，然后計(jì)算不同體積比的樣品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。

式中:V空為鄰苯三酚自氧化速率;V樣為鄰苯三酚加入樣品后的氧化速率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 溶劑的選擇

通過查閱大量的相關(guān)文獻(xiàn)，得出七種提取種子油的常用溶劑，即無水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、和三氯甲烷。利用這些溶劑對(duì)構(gòu)樹種子油進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三氯甲烷密度過小，不適合做構(gòu)樹種子油的溶劑，故本實(shí)驗(yàn)不予考慮。結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同試劑對(duì)構(gòu)樹種子油提取率影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction yield of B.papyrifer seed oil

如圖1 所示，丙酮提取率為29.5%，比乙醚低0.9%、比乙酸乙酯低0.3%，但比無水乙醇、石油醚和正己烷的提取率分別高7.80%、3.95%、1.75%。由于丙酮是提取油脂常用試劑，其沸點(diǎn)比構(gòu)樹種子油沸點(diǎn)低、密度大、毒性小、同時(shí)價(jià)格較低，所以選用丙酮提取構(gòu)樹種子油。

3.2 超聲波強(qiáng)化提取構(gòu)樹種子油

3.2.1 超聲波強(qiáng)度對(duì)構(gòu)樹種子油提取率的影響

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稱量研磨構(gòu)樹種子，在不同超聲波強(qiáng)度下各自提取5 min，料液比(g∶mL)為1∶10，測(cè)定提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波強(qiáng)度對(duì)提取率影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on extraction yield of B.papyrifer seed oil

由圖2 可見，超聲波強(qiáng)度越大，構(gòu)樹種子油提取率越高。當(dāng)超聲波強(qiáng)度為20%時(shí)，構(gòu)樹種子油提取率為23%，超聲波強(qiáng)度為40%時(shí)，提取率為24%。這是由于超聲波強(qiáng)度越大，空化現(xiàn)象越劇烈，媒質(zhì)粒子速度和加速度亦越大，界面擴(kuò)散層上分子擴(kuò)散就越快［8］，構(gòu)樹種子油脂滲透出來的速度就越大，但當(dāng)超聲波強(qiáng)度達(dá)到一定值(60%)時(shí)，由于構(gòu)樹種子內(nèi)滲透壓達(dá)到平衡，構(gòu)樹種子油提取率便趨于穩(wěn)定。

3.2.2 料液比對(duì)構(gòu)樹種子油提取率影響

在超聲波強(qiáng)度為60%，超聲處理時(shí)間為5 min條件下，比較料液比(g/mL)對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 料液比對(duì)提取率影響Fig.3 Effects of ratio of solid to liquid on extraction yield of B.papyrifer seed oil

由圖3 可知，構(gòu)樹種子油提取率與料液比有關(guān)，當(dāng)料液比(g/mL)為1∶8 時(shí)，提取率(28%)要比料液比(g/mL)為1∶4(21.3%)時(shí)提取率高6.7%。因?yàn)槿軇┝吭黾?，?huì)降低溶劑中構(gòu)樹種子油濃度，增加構(gòu)樹種子油與溶劑接觸界面處濃度差，從而提高傳質(zhì)速率，在一定時(shí)間內(nèi)提取率增大。但當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)，大部分構(gòu)樹種子油已被提取出，再增加溶劑用量，提取率基本保持不變，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，溶劑用量不宜太大［9］。

3.2.3 超聲波提取時(shí)間對(duì)構(gòu)樹種子油提取率影響

當(dāng)超聲波強(qiáng)度為60%，料液比(g∶mL)為1∶10時(shí)，研究處理時(shí)間對(duì)構(gòu)樹種子油提取率影響，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of treatment time on extraction yield of B.papyrifer seed oil

由圖4 所示，超聲波處理時(shí)間越長，原料顆粒被粉碎機(jī)會(huì)越多［10］，油脂浸出越充分。當(dāng)超聲波提取時(shí)間為2 min 時(shí)，提取率僅為24%，而當(dāng)提取時(shí)間增加到5 min 時(shí)，提取率則達(dá)26%。且5 min 后，體系滲透壓達(dá)到平衡，提取率趨于穩(wěn)定?？梢姵暡茉诙虝r(shí)間(5 min)內(nèi)對(duì)構(gòu)樹種子油進(jìn)行充分提取。

3.2.4 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

在以上單因素提取實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了考察多因素綜合效應(yīng)，以超聲波強(qiáng)度、料液比、超聲提取時(shí)間為因素，以均勻設(shè)計(jì)法觀察影響提取率的各個(gè)因素。超聲波強(qiáng)化提取構(gòu)樹種子油均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如下。

表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of uniform design

通過均勻設(shè)計(jì)分析，得到結(jié)果如表2 所示，超聲波強(qiáng)化提取構(gòu)樹種子油最優(yōu)條件為A65B1∶12C7(實(shí)驗(yàn)3)，即超聲波強(qiáng)度為65%，料液比(g/mL)為1∶12，時(shí)間為7 min;各因素對(duì)超聲波強(qiáng)化提取構(gòu)樹種子油影響大小次序?yàn)?超聲波強(qiáng)度＞料液比(g/mL)＞超聲時(shí)間。

3.3 構(gòu)樹種子油抗氧化活性的測(cè)定

3.3.1 DPPH 自由基的清除能力

構(gòu)樹種子油對(duì)DPPH 自由基的清除能力如圖5所示。由結(jié)果可以看出，構(gòu)樹種子油對(duì)DPPH 自由基的清除率隨著油濃度的增加而增加，平均清除率高達(dá)91.21%，有顯著的清除能力。

圖5 不同濃度油對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.5 Clearance rate of different concentrations of B.papyrifer seed oil to DPPH radicals

3.3.2 超氧陰離子自由基(O-·2) 清除作用

圖6 不同濃度構(gòu)樹種子油對(duì)超氧陰離子抑制曲線Fig.6 Inhibitory curves of different concentrations of B.papyrifer seed oil to superoxide anion

構(gòu)樹種子油對(duì)超氧陰離子自由基(O-·2)的清除作用結(jié)果如圖6 所示，通過計(jì)算，得出加入構(gòu)樹種子油后，氧化的速率并沒有減小，故構(gòu)樹種子油對(duì)超氧陰離子自由基的抑制能力很低。

4 結(jié)論

提取油脂理想溶劑具有以下特性:對(duì)油脂溶解性好、選擇性好;物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定;無腐蝕性、無毒性;沸點(diǎn)低、易于回收、不殘留;價(jià)格低廉，來源廣泛。實(shí)際上目前國內(nèi)外尚無這種理想溶劑，各種溶劑都有一定優(yōu)缺點(diǎn)［10］，本文通過對(duì)構(gòu)樹種子油最佳溶劑的篩選試驗(yàn)，得出丙酮是提取構(gòu)樹種子油的理想溶劑。

利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈震動(dòng)、空化效應(yīng)等作用，可提高效率、改善油脂品質(zhì)、節(jié)約原料、提高出油率。因此，把超聲波作為生產(chǎn)工藝一種手段，在油脂加工提取中將發(fā)揮巨大作用。本文應(yīng)用超聲波強(qiáng)化提取法對(duì)構(gòu)樹種子油進(jìn)行提取，由均勻設(shè)計(jì)法實(shí)驗(yàn)得出構(gòu)樹種子油最佳提取工藝參數(shù)為:超聲波強(qiáng)度為65%，料液比(g/mL)為1∶12，時(shí)間為7 min，提取率高達(dá)30.2%。

構(gòu)樹種子油具有較好的清楚羥基自由基的作用，平均清除率高達(dá)91.21%。隨著油濃度的增加，抑制率增加。而構(gòu)樹種子油無清除超氧陰離子自由基的能力。

1 Zheng HZ(鄭虎占)，Dong ZH(董澤宏)，Yu J(余靜).Modern Study of Traditional Chinese Medicine(中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用).Beijing:Academy Press，1999.

2 Yuan X(袁曉)，Yuan P(袁萍).Study on supercritical carbon dioxide extraction ofBroussonetia papyriferseed oil.Chin Tradit Drug(中草藥)，2005，36:1136-1138.

3 Tao HJ(陶弘景).Transactions of Famous Physicians(名醫(yī)別錄).Beijing:People's Medical Publishing House，1986.

4 Yan XP(嚴(yán)小平)，Li CP(李成平)，Jin JC(金建昌).Study on optimum extraction of water melon seed oil by ultrasonic oil.J Chin Cereals Oils Assoc(中國糧油學(xué)報(bào))，2012，27(3):53-55.

5 Wen J(文鏡)，He SH(賀素華)，Yang YY(楊育穎)，et al.Thein vitroexperimental method and principles for the elimination of free radicals by health functional foods.Food Sci(食品科學(xué))，2004，25:190-195.

6 Wei XY(魏希穎)，Xu HX(徐慧嫻)，Yang XJ(楊小軍)，et al.Analysis of essential oil ofForsythia suspense(Thunb.)Vahl.by GC-MS and its antioxidant activities.J Shaanxi Normal Univ，Nat Sci Ed(陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2010，38(1):70-74.

7 Chou H(仇海).Microwave extraction and free radical scavenging activity ofAblmoschus manihot(L.)Medic seed oil.Food Sci(食品科學(xué))，2010，31:111-113.

8 Han JQ(韓軍岐)，Zhang YL(張有林)，Dai GH(戴桂花)，et al.Study on the extraction of sunflower seed oil by ultrasonic wave treatment.J Cereals Oils(中國糧油學(xué)報(bào))，2004，9:24-25.

9 Zhou RJ(周如金)，Gu LJ(顧立軍)，Li ZG(黎周國)，et al.Study on ultrasonically aided solvent extraction of walnut oil.Food Sci(食品科學(xué))，2003，24(10):34-37.

10 Hu AJ(胡愛軍)，Qiu TQ(丘泰球)，Liang HH(梁漢華).Study on ultrasonically aided solvent extraction ofCoix Lacryma-jobiseed oil.Mod Chem Ind(現(xiàn)代化工)，2002，22(10):34-37.