劉璐璐，王洲婷，丁傳波，李 爽，李 偉，劉文叢，鄭毅男

吉林農業(yè)大學中藥材學院，長春 130118

菜用大豆(Glycine maxL.Merr)也叫毛豆，日本稱枝豆，是指在R6(鼓粒盛期)至R7(初熟期)生育期間采青作為食用的大豆，屬大豆的專用型品種。此時豆莢鼓粒飽滿，莢色、籽粒呈翠綠色、籽粒還沒有達到完全成熟時，但籽粒填充達到莢長的80%～90%［1］。毛豆富含植物蛋白質、維生素、礦物質、纖維以及大豆異黃酮［2］。毛豆因其獨特的口感和風味，被譽為最美味、最富營養(yǎng)的綠色保健蔬菜，是深受亞洲人喜愛的特色蔬菜［3］。

大豆異黃酮(soy isoflavones)是大豆等豆科植物生長過程中形成的一類次生代謝物，迄今為止有12種異構體，其中3 種為苷元形式即染料木素(genistein)、大豆黃素(daidzein)和黃豆黃素(glycitein)，9 種為葡糖苷形式［4］。據(jù)報道，大豆異黃酮苷元比糖苷更容易被人體吸收［5］，并且大豆苷元和燃料木素是有益于健康的主要成分［6］。大豆異黃酮有益于減輕糖尿病患者的體重以及控制患者血漿胰島素水平和葡萄糖水平［7］。卜勇軍等［8］研究表明，大豆異黃酮可降低糖尿病小鼠腎缺血再灌注損傷后血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等水平，對預防糖尿病具有一定的意義。

據(jù)文獻［9］報道，大豆攝入對于糖尿病并無顯著作用，而關于毛豆的抗糖尿病研究，尚未見報道。

本文采用HPLC 法對不同處理方式(熱燙、煮沸、冷凍、凍干、烘干)條件下毛豆中大豆異黃酮苷元進行含量測定，并對凍干條件下處理的毛豆樣品進行了降血糖降血脂活性的研究。本研究首次對凍干毛豆對糖尿病小鼠的降血糖降血脂活性進行了研究，為毛豆的保存及其抗糖尿病活性提供了理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

毛豆，購自農貿市場;染料木素、大豆苷元、黃豆黃素(純度＞98%)，成都曼斯特生物科技有限公司;甲醇、甲酸均為色譜純;96 孔酶標板(美國康寧公司)，鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma 公司)，消渴丸(廣州中一藥業(yè)有限公司)，葡萄糖試劑盒(氧化酶法)(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，總膽固醇試劑盒(酶法)(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，甘油三酯試劑盒(酶法)(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，HDLC 試劑盒(選擇性沉淀法)，葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、冰醋酸、乙醇、二甲苯(分析純)(北京化工廠)，甲醛，分析純(沈陽經濟技術開發(fā)區(qū)試劑廠)，生理鹽水(長春豪邦藥業(yè)有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，

1.2 儀器與設備

Shimadzu LC-20A 高效液相色譜儀(SPD-20A 紫外檢測器，LC-20AT 泵，CTO-10AS VP 柱溫箱，LCsolution 工作站)日本島津公司;Sartorius BP211D 型電子分析天平 德國賽多利斯公司;KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲波儀器有限公司;FW135 中草藥粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋天津泰斯特儀器有限公司;DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;冷凍干燥機FD-1D-50 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;SpectraMax Plus384 連續(xù)光譜掃描式酶標儀(美國分子儀器公司)，Sartorius PB10標準型pH 計(德國賽多利斯公司)，HC2517 高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，F(xiàn)S-2 組織勻漿機(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)。

1.3 實驗動物

雄性ICR 小鼠，SCXK-(吉)2007-0003，體重25～28 g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心，飼養(yǎng)室溫度23 ± 2 ℃，濕度50 ± 5%，小鼠自由攝食和飲水，適應性飼養(yǎng)一周。

2 實驗方法

2.1 不同處理方式下毛豆中大豆異黃酮苷元的含量測定

2.1.1 HPLC 條件

Shimadzu LC-20A 高效液相色譜儀，色譜柱:依利特Hypersil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相:甲醇-0.3%磷酸溶液(體積比48∶52)，流速0.7 mL/min，測定波長260 nm，柱溫25 ℃，進樣量:20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

對照品儲備液:稱取染料木素、大豆苷元、黃豆黃素各5.0 mg，精密稱定，分別置于25 mL 容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為0.2 mg/mL 的對照品儲備液;對照品溶液:精密量取三種對照品儲備液各1 mL，混勻，即得對照品溶液，其中三中大豆異黃酮苷元質量濃度均為0.067 mg/mL。

2.1.3 樣品前處理

將新鮮毛豆去莢后，進行以下處理。

(1)熱燙100 g 毛豆用紗布包好，放在沸水中熱燙1 min，在冰水中冷卻，取出吸干水分;(2)煮沸100 g 毛豆加水(重量/體積1∶1)煮沸35min，吸干水分;(3)冷凍100 g 毛豆用紗布包好，放在沸水中熱燙1 min，在冰水中冷卻，取出吸干水分，放于密封袋中，-80 ℃保存一小時，-20 ℃保存2 周;(4)凍干100 g 毛豆用紗布包好，放在沸水中熱燙1 min，在冰水中冷卻，取出吸干水分，放于密封袋中，-80 ℃保存一小時，冷凍干燥18～26 h;(5)烘干100 g 毛豆放置烘箱中48 h，直至烘干，取出。

2.1.4 供試樣品提取

將樣品粉碎，稱取1 g(干重)，置250 mL 容量瓶中，加入50 mL 乙醇，20 mL 去離子水，8 mL 濃鹽酸?；亓? h，濃縮至10 mL，過濾膜，備用。

2.2 毛豆降血糖降血脂活性研究

2.2.1 動物模型

取健康雄性ICR 小鼠若干，基礎飼料適應性飼養(yǎng)一周，隨機取10 只作為空白對照組，其余小鼠給以高脂飼料(脂肪22%、蛋白質20%、碳水化合物48%、包括纖維素及水分在內的其他成分占10%，總熱量為44.3 kJ/kg)飼養(yǎng)4 周，小鼠禁食不禁水12 h 后，腹腔注射鏈脲佐菌素100 mg/kg(溶于0.1 M新配制的檸檬酸緩沖鹽溶液中，pH 4.5)，繼續(xù)以高脂飼料飼養(yǎng)4 周后，測定空腹血糖，血糖值高于7.8 mmol/L 的小鼠作為2 型糖尿病造模成功小鼠。

2.2.2 分組及給藥

將造模成功的小鼠隨機分3 組，每組10 只。給藥劑量分別為消渴丸240 mg/kg，毛豆組2.25g/kg正常組及模型組給以等體積的生理鹽水。小鼠每日給藥一次，連續(xù)給藥4 周。

將凍干的毛豆粉碎，加入適量的水，勻漿機勻漿，煮熟，制成豆?jié){。

2.2.3 血糖血脂指標的測定

給藥4 周后，各組小鼠測定空腹血、口服葡萄糖耐量、血清TC、TG。

2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)結果以平均值± 標準差來表示。用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，使用one-way ANOVA 法，方差采用LSD 法分析處理數(shù)據(jù)。

3 結果與分析

3.1 方法學考察

3.1.1 線性關系

精密吸取大豆異黃酮苷元對照品混合溶液4、8、12、16、20 μL 進樣，以峰面積積分值A 為縱坐標，進樣量B 為橫坐標進行線性回歸，得三種活性物質回歸方程分別為:

結果表明，大豆苷元、黃豆黃素、染料木素均在0.268～1.340 μg 范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

3.1.2 精密度試驗

取對照品溶液，重復進樣5 次，記錄色譜圖，測定峰面積值，計算RSD 值，得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD 分別為1.64%、1.76%和1.94%。實驗表明，儀器精密度良好。

3.1.3 重復性試驗

取同一批次大豆異黃酮苷元混合物5 份，按2.1.2 項下，制備樣品溶液，測定峰面積值，計算RSD 值，得大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的RSD 分別為2.2%，2.73%和2.51%。表明該法重復性良好。

圖1 混合標準品(A)及經熱燙(B)、煮沸(C)、冷凍(D)、凍干(E)、烘干(F)處理后毛豆樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards(A)and the edamame samples after banching(B)、boiling(C)、freezing(D)、freeze-dried(E)、drying(F)

表1 不同處理方式條件下毛豆中大豆異黃酮含量(ug/g)Table 1 Soybean isoflavone content of edamame in different treatment conditions(ug/g)

3.1.4 穩(wěn)定性試驗

取同一樣品溶液分別在0、2、4、6、8、12 h 于上述色譜條件下測定峰面積值，計算RSD 值，得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的RSD 分別為1.89%、2.35%和1.96%。表明供試品溶液在12h 內穩(wěn)定性良好。

3.1.5 回收率試驗

取大豆異黃酮苷元混合物，精密稱定，分別準確加入對照品溶液各適量，余同2.1.2 項下操作。分別計算得大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率。檢測結果表明，平均加樣回收率分別為:97.6%、101.8%、98.4%;RSD 分 別 為:1.8%、2.2%、1.76% 。表明該法的回收率結果良好。

3.2 含量測定

取供試品溶液，在2.1.1 節(jié)色譜條件下進樣分析，結果如圖1，具體含量見表1。

3.3 動物實驗

測定2 型糖尿病小鼠空腹血糖及口服糖耐量結果如圖3、圖4、圖5，血清TC、TG 如表2 所示。

4 討論

圖3 2 型糖尿病小鼠空腹血糖Fig.3 Fasting blood glucose level of T2MD mice

圖4 2 型糖尿病小鼠餐后血糖Fig.4 Postprandial blood glucose level in type 2 diabetic mice

圖5 2 型糖尿病小鼠口服糖耐量Fig.5 Oral glucose tolerance in T2DM mice

表2 2 型糖尿病小鼠血脂指標(Mean±SD，mmol/L)Table 2 Blood lipid levels in type 2 diabetic mice(Mean±SD，mmol/L)

實驗結果顯示，凍干條件下，毛豆中保留的大豆異黃酮含量最多，烘干次之。說明這幾種處理方式相比較而言，凍干條件下能夠很好地保留毛豆中大豆異黃酮的含量。熱燙和煮沸是毛豆自身的大豆異黃酮損失的主要原因。煮沸，由于其加熱時間足夠長，從而使毛豆中某些物質轉變?yōu)榇蠖管?，染料木苷和染料木素?0］。本研究通過酸水解，使經過煮沸轉化而來的大豆異黃酮苷轉變?yōu)橄鄳能赵瑥亩黾恿酥蠓袠悠分写蠖管赵腿玖夏舅氐暮?但與熱燙處理的樣品相比較，煮沸可能會使更多的大豆異黃酮損失在水中。本研究中烘干處理的毛豆未經過熱燙，所以其異黃酮含量僅低于凍干條件下處理的毛豆樣品。而冷凍的樣品中，大豆異黃酮苷元含量最少，說明冷凍不利于毛豆中大豆異黃酮苷元含量的保存。動物實驗結果顯示，凍干的毛豆能夠顯著改善糖尿病小鼠的血糖血脂水平，雖然能夠改善糖尿病小鼠的口服糖耐量，但與模型組相比，差異并不顯著。

據(jù)報道［11］，豆類調節(jié)血糖和血脂代謝的主要原因是其含有高濃度的大豆異黃酮，說明毛豆中還含有一些其它的成分，對調節(jié)糖尿病小鼠的血糖血脂也有一定的作用。本研究表明真空凍干毛豆能夠顯著改善糖尿病小鼠的血糖血脂水平，其他幾種加工方法是否對糖尿病小鼠也有治療作用，這些有待進一步研究加以證明，也就是說大豆異黃酮苷元含量的多少，或許可能不是改善糖尿病的主要原因，究竟還有何種物質存在，這些都有待進一步研究加以證實。

本文研究結果顯示，凍干條件下處理的毛豆樣品，其大豆異黃酮苷元含量最多;所以我們首先對凍干毛豆的抗2 型糖尿病的活性進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，凍干的毛豆能顯著改善2 型糖尿病小鼠的血糖和血脂水平。這可能是毛豆中的大豆異黃酮與毛豆中其他成分共同作用的結果。

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