肖 兵 葉敏華 周 旋 吳淼經(jīng) 韓 磊 康春生 祝新根

膠質(zhì)瘤是人類(lèi)最常見(jiàn)的顱腦腫瘤，其惡性程度高，40%膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存期不超過(guò)1年［1］。因此，研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找膠質(zhì)瘤治療的新策略和靶點(diǎn)，成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容。VHL（Von Hippel Lindau）基因作為一種抑癌基因［2］，由Hippel等［3-4］最先發(fā)現(xiàn)，與膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)［5-6］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中MMP-2、MMP-9成為腫瘤侵襲機(jī)制研究的熱點(diǎn)［7］。本研究通過(guò)VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，上調(diào)VHL基因的表達(dá)，觀(guān)測(cè)其對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，探討將VHL作為膠質(zhì)瘤基因治療靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，VHL表達(dá)質(zhì)粒為本室保存。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，VHL mRNA引物購(gòu)自中國(guó)Genepharma公司，GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記、山羊抗鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司，VHL抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，MMP-2、MMP-9抗體購(gòu)自中國(guó)SAB公司，RNA提取試劑Trizol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃5%CO2的條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，設(shè)為空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組，培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)VHL mRNA表達(dá)水平 提取經(jīng)轉(zhuǎn)染孵育24 h后細(xì)胞總RNA。引物由上海吉瑪公司合成，RT-PCR法檢測(cè)VHL mRNA基因的表達(dá)水平。與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組進(jìn)行比較。

1.2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白 提取經(jīng)VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染孵育24 h后細(xì)胞總蛋白，離心后取上清電泳，完畢后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（膜須甲醇激活），封閉1 h，分別加入VHL、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗（1∶1 000），4℃過(guò)夜。漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光定影。

1.2.5 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel過(guò)夜解凍，稀釋后的Matrigel涂于細(xì)胞生長(zhǎng)面。將饑餓12～24 h后的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用含0.1%FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至5×105/cm2。取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室，含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL加入下室。培養(yǎng)48 h后，擦去Matrigel和上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min；0.1%結(jié)晶紫室溫染色10 min，清水漂洗3遍。Transwell小室翻過(guò)來(lái)底面朝上置顯微鏡下觀(guān)察拍照。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 分別將轉(zhuǎn)染VHL質(zhì)粒組、空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞接種于6孔板中，待其貼壁之后用200 μL槍頭垂直于6孔板底部劃痕，加入培養(yǎng)基后用倒置相差顯微鏡記錄此時(shí)及48 h后細(xì)胞的遷移情況。

1.2.7 顱內(nèi)模型的建立及標(biāo)本制作 取4～6周齡雌性裸小鼠（本實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞（用作對(duì)照組）及經(jīng)VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞常規(guī)消化后制成單細(xì)胞懸液，小鼠常規(guī)腹腔麻醉后消毒備皮，將制成的單細(xì)胞懸液利用立體定向儀接種于鼠腦右側(cè)尾狀核頭部，縫合切口，動(dòng)物蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。細(xì)胞接種后第14天將小鼠斷頭取腦組織，制成切片。

1.2.8 免疫組織化學(xué)染色 切片60℃烘烤1 h后常規(guī)脫蠟，熱修復(fù)法行抗原修復(fù)，室溫冷卻后PBS緩沖液洗3次，1%BSA室溫封閉，滴加VHL、MMP-2、MMP-9一抗4℃過(guò)夜，復(fù)溫1 h，PBS洗后滴加二抗，37℃孵育30～40 min，PBS洗后滴加三抗，37℃孵育40～60 min，洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸分化返藍(lán)后梯度脫水，透明封片，顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組比較，VHL mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

2.2 Western blot分析結(jié)果

Western blot結(jié)果表明，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染VHL表達(dá)質(zhì)粒組中，VHL蛋白的表達(dá)較空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯升高；MMP-2的表達(dá)較空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯降低；MMP-9的表達(dá)較空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯降低（圖2）。

圖1 轉(zhuǎn)染VHL表達(dá)質(zhì)粒后U251細(xì)胞中VHL mRNA表達(dá)水平Figure 1 Expression of VHL mRNA in U251 cells after transfection by VHL expression plasmid

2.3 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀(guān)察48 h后，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞組中空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組平均視野侵襲細(xì)胞數(shù)為（58.88±3.93）、（57.63±2.92）個(gè)，而轉(zhuǎn)染VHL表達(dá)質(zhì)粒后平均視野侵襲細(xì)胞數(shù)為（18.81±2.22）個(gè)，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組比較侵襲能力明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3）。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀(guān)察48 h后，計(jì)算遷移至劃痕區(qū)檢測(cè)視野內(nèi)的U251細(xì)胞總數(shù)，空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體組分別為（135.20±6.20）個(gè)和（127.60±5.53）個(gè)，而VHL表達(dá)質(zhì)粒組則為（34.80±5.29）個(gè)，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體比較遷移細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4）。

2.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

VHL、MMP-2、MMP-9陽(yáng)性信號(hào)均定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色染色，發(fā)現(xiàn)VHL表達(dá)質(zhì)粒處理組中VHL的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，MMP-2、MMP-9的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少（圖5）。再次驗(yàn)證VHL表達(dá)水平上升后MMP-2、MMP-9表達(dá)降低。

圖2 轉(zhuǎn)染VHL表達(dá)質(zhì)粒后U251細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of related protein in U251 cells after transfection by VHL expression plasmid

圖3 U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染VHL表達(dá)質(zhì)粒48 h后Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×1 000）Figure 3 Results of Transwell experiment 48 h after the transfection of U251 cells by VHL expression plasmid （×1 000）

圖4 U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染VHL表達(dá)質(zhì)粒48 h后劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×200）Figure 4 Results of wound-healing experiment 48 h after transfection of U251 cells by VHL expression plasmid（×200）

圖5 不同處理后顱內(nèi)模型制成的組織切片中VHL、MMP-2、MMP-9表達(dá)（×200）Figure 5 The expression of VHL，MMP-2 and MMP-9 in tissue sections from intracranial models with different treatments（×200）

3 討論

膠質(zhì)瘤惡性程度高，預(yù)后較差［8］，以手術(shù)治療為主，但由于腫瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與腦組織間無(wú)明顯邊界，整體療效仍不理想。隨著對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制逐漸深入研究，出現(xiàn)了越來(lái)越多的基因治療，如抗血管生成治療［9］、乏氧腫瘤靶向治療［10］、RNA干擾治療［11］等，均取得一定的療效。

VHL基因定位于3p25～26區(qū)［12］，編碼213個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，稱(chēng)為VHL蛋白，是一種重要的腫瘤抑制基因［13-14］，腫瘤發(fā)生與VHL基因突變相關(guān)，參與多種腫瘤的發(fā)生，如腎細(xì)胞癌、胰腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤等［2］，VHL與膠質(zhì)瘤的關(guān)系主要為VHL可通過(guò)參與HIF-1α泛素化降解的過(guò)程［15-16］影響VEGF（vascular endothelial growth factor）的表達(dá)，而VEGF是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中最為重要的血管形成因子［17］。VHL除了調(diào)節(jié)HIF-α水平和抗血管生成外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［18］、細(xì)胞凋亡［19］、細(xì)胞外基質(zhì)的作用［20］。孫學(xué)英等［21］在抑癌基因VHL治療實(shí)體腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究中利用脂質(zhì)體法向小鼠實(shí)體腫瘤中注射pcDNA3-VHL基因，能顯著抑制實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)；Chen等［22］將正常的VHL基因轉(zhuǎn)入不表達(dá)VHL蛋白的腎癌細(xì)胞中，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。表明VHL可作為膠質(zhì)瘤基因治療中一個(gè)有效的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，上調(diào)VHL基因表達(dá)，MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低，有效降低U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，為以VHL為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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