魏熙胤 王 晶 臧鳳琳 張 飛 劉竹君 張翠翠 李 凱

抗血管生成聯(lián)合化療可明顯延長非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的無進(jìn)展生存期和總生存期而廣泛用于臨床。但此類藥物的特點(diǎn)在于抑制腫瘤生長，而非迅速縮小瘤體，在以腫瘤體積變化為基礎(chǔ)的評價(jià)體系中，其效果常被低估。因而，尋找有效的評估標(biāo)志物已成為重要研究方向?？寡苌伤幬锏闹饕悬c(diǎn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞（circulating endothelial cells，CECs）。Beaudry等［1］證實(shí)荷瘤動(dòng)物CECs變化與血管內(nèi)皮抑素的抑瘤效果顯著相關(guān)。CECs的主要來源包括骨髓中的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞和周圍血管壁上的活化內(nèi)皮細(xì)胞（activated CECs，aCECs）。其變化反應(yīng)抗血管與促血管生成因子相互拮抗的最終結(jié)果，可能成為評估抗血管生成的有效標(biāo)志物［2］。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測NSCLC中aCECs數(shù)量，分析aCECs與抗血管生成療效的關(guān)系，以期尋找反映抗血管生成療效的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診、局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者、未行化療或僅接受一線治療。其他條件包括：病灶單徑≥1 cm；身體狀況評分標(biāo)準(zhǔn)（ECOG）≤2分；預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月；無生物制劑等藥物過敏史；患者自愿參加并簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：未控制的急性感染或腦轉(zhuǎn)移；嚴(yán)重心臟病史；明顯出血傾向；既往應(yīng)用恩度治療等。選取2009年3月至2011年12月本院收治的142例NSCLC患者，均經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診，其中男性88例，女性54例，年齡25～75歲。腺癌77例，鱗狀細(xì)胞癌49例，其他類型16例。TNM臨床分期：ⅢB期53例，Ⅳ期89例。另選取30例健康志愿者作為健康對照組，僅采外周血行CECs檢查而不行治療。此項(xiàng)研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.1 治療方法 化療組71例：長春瑞濱聯(lián)合順鉑（NP方案）：長春瑞濱25 mg/m2，第1、8天；順鉑25 mg/m2，第2～4天。聯(lián)合組71例：NP方案聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素（恩度）：恩度7.5 mg/m2、第1～14天連續(xù)給藥，伴隨上述NP方案。所有藥物的給藥方式均為靜脈滴注，21～28天為1個(gè)周期，共6個(gè)周期，至有明確進(jìn)展或出現(xiàn)不能耐受毒副作用時(shí)出組。

1.2.2 療效評定 依實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定治療效果，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進(jìn)展（progression disease，PD）［3］?；颊哂诨熐?、化療期間每2個(gè)周期檢測強(qiáng)化CT、MRI或PET-CT，對SD及以上療效4周后確認(rèn)，必要時(shí)隨時(shí)檢查。腫瘤進(jìn)展時(shí)間（time to progression，TTP）為從隨機(jī)開始至疾病進(jìn)展的時(shí)間。療效經(jīng)由獨(dú)立的療效評估委員會(huì)再評估。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測aCECs 治療前3天內(nèi)及每個(gè)周期治療后3天內(nèi)取1 mL靜脈血，流式細(xì)胞術(shù)檢測研究對象血清aCECs水平和基線范圍：1）各取抗凝全血0.1 mL，分別加入實(shí)驗(yàn)管和同型對照管。實(shí)驗(yàn)管中加入FITC標(biāo)記小鼠抗人CD105 10 μL、PE標(biāo)記小鼠抗人CD146 10 μL、PE-Cy5標(biāo)記小鼠抗人CD45 10 μL，對照管中分別加入FITC標(biāo)記小鼠IgG1 10 μL、PE標(biāo)記小鼠IgG1 10 μL、PE-Cy5標(biāo)記小鼠IgG2a 10 μL，避光孵育30～45 min。所有試劑均購自美國貝克曼庫爾特公司。2）向上述管中各加入紅細(xì)胞裂解液Opti-Lyse C 0.5 mL，孵育15 min，加PBS常規(guī)清洗，離心后棄上清，加入0.5 mL鞘液，振蕩混勻待測。3）以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球常規(guī)校準(zhǔn)儀器的變異系數(shù)并穩(wěn)定在2以內(nèi)，運(yùn)用邏輯設(shè)門方法（圖1）確定目標(biāo)細(xì)胞，收集10萬個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞發(fā)出的熒光測定表達(dá)率并計(jì)算CD45-CD105+CD146+細(xì)胞數(shù)［4-5］。4）計(jì)算aCECs的變化差值：差值=治療后值-治療前值。

1.2 方法

圖1 邏輯設(shè)門：在左圖中采集10萬個(gè)外周血細(xì)胞為研究背景；中圖縱坐標(biāo)為CD45，橫坐標(biāo)為CD146，其中左上相限和右上相限為CD45陽性細(xì)胞即白細(xì)胞予以排除，右下相限為CD146單陽性細(xì)胞；右圖縱坐標(biāo)為CD146，橫坐標(biāo)為CD105；右圖右上相限為CD146、CD105雙陽性細(xì)胞即活化血管內(nèi)皮細(xì)胞（CD45-CD146+CD105+）Figure 1 Gating logic:The left illustration shows the gate used to exclude the platelets,dead cells,and debris.We collected 100,000 peripheral blood cells for study.In the middle illustration,the ordinate was CD45,and the abscissa was CD146.The upper left quadrant and upper right quadrant exhibit leukocytes,which were excluded,and the lower right quadrant illustrates CD146+cells.The ordinate of the right illustration was CD146,and the abscissa was CD105.The upper right quadrant shows CD45+CD146+CD105+cells,namely,aCECs

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對計(jì)量指標(biāo)計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、最小值、最大值，對分類指標(biāo)計(jì)算各類別的例數(shù)及百分?jǐn)?shù)。因aCECs為非正態(tài)分布，故取自然對數(shù)ln使之正態(tài)化后再進(jìn)行計(jì)算。Cox回歸分析模型分析疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)比（hazards ratio，HR）、評價(jià)各因素對TTP、OS的影響。在Cox回歸中將aCECs差值按≤0分、0～10分、11～100分、＞100分為4個(gè)亞層，分別定義為aCECs1、aCECs2、aCECs3、aCECs4。雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效

2.1.1 短期療效 2個(gè)周期后聯(lián)合組CR 0例，PR 10例，SD 48例，ORR、CBR分別為14.1%和81.7%；化療組CR 0例，PR 2例，SD 51例，ORR、CBR分別為2.8%和74.6%；兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.1.2 遠(yuǎn)期療效 隨訪至2012年12月，聯(lián)合組與化療組中位TTP分別為7.3個(gè)月和5.3個(gè)月（P=0.038）。

2.2 aCECs治療中的變化及意義

2.2.1 基線情況 健康對照組基線范圍為（45，12～215）/105細(xì)胞，ln aCECs（1.7±0.3）；化療組基線范圍為（67，25～335）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.4±1.7）；聯(lián)合組基線范圍為（75，35～390）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.7±1.5）。對照組性別、年齡與臨床試驗(yàn)患者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，aCECs數(shù)量明顯低于治療組（P=0.006）。兩試驗(yàn)組間aCECs比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且與性別、年齡、病理類型及臨床分期均不相關(guān)（P＞0.05）。

2.2.2 治療中的變化 1）化療組aCECs變化：治療后第1、2、3、4個(gè)周期aCECs分別為（105，65～404）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.5±1.8）；（175，125～470）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.0 ±1.5）；（254，205～714）/105細(xì) 胞 ，ln aCECs（5.2± 1.9）和（110，150～480）/105細(xì) 胞 ，ln aCECs（4.8±1.9）。其中第3個(gè)周期數(shù)值與基線相比，明顯升高（P=0.040）。2）聯(lián)合組aCECs變化：除常規(guī)化驗(yàn)外，聯(lián)合組患者于第 8、29、50、71天加驗(yàn)aCECs。結(jié)果顯示：治療前、第8天、第1個(gè)周期后、第29天、第2個(gè)周期后、第50天、第3個(gè)周期后、第71天、第4個(gè)周期后aCECs分別為（77，42～314）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.3±1.1）；（178，50～425）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.2±1.7）；（46，9～522）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.6±1.2）；（181，78～727）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.2±1.5）；（126，62～256）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.0±1.3）；（322，106～467）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.5±0.9）；（100，44～131.3）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.6±1.3）；（465，117～851）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.9±1.2）和（180，68～744）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.3±1.3）。其中，第8天、第29天、第2個(gè)周期后、第50天、第71天、第4個(gè)周期后aCEC均較基線明顯升高（P＜0.05），而其余聯(lián)合組各取血點(diǎn)aCECs變化較基線差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.3 aCECs數(shù)量與療效的相關(guān)性 化療組PD患者與非PD患者aCECs基線分別為（75，40～352）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.2±1.6）和（55，25～290）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.3±1.4）。聯(lián)合組PD患者與非PD患者aCECs分別為（59，25～110）/105細(xì)胞，ln aCECs（3.8±1.7）和（65，24～285）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.3±1.8）。不同治療組內(nèi)PD與非PD患者的aCECs數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過比較治療前、后aCECs變化發(fā)現(xiàn)，PD患者與非PD患者在化療或聯(lián)合治療后，aCECs均較治療前有所升高，但僅PD患者aCECs數(shù)量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（化療組，P=0.041；聯(lián)合組，P=0.020）。

化療聯(lián)合恩度治療患者非PD與PD組aCECs數(shù)值分別為（65，40～190）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.2±1.3）和（75，50～214）/105細(xì)胞，ln aCECs（3.8±1.5），兩者差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但在不同治療方式中，PD患者于治療后aCECs升高差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.4 兩組不同療效患者aCECs波動(dòng)情況 1）化療組中PD病例平均治療2個(gè)周期，治療前aCECs為（75，40～352）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.2±1.6）；2個(gè)周期后為（170，150～570）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.3±1.7），較基線明顯升高（P=0.041）。非PD病例平均治療3個(gè)周期，治療前 aCECs為（55，25～290）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.3±1.4）；第3個(gè)周期后為（45，10～300）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.6±1.5），aCECs升高與基線相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。2）聯(lián)合組中PD病例平均治療2個(gè)周期，治療前及1、2個(gè)周期后aCECs值分別為（59，25～100）/105細(xì)胞，ln aCECs（3.8±1.7）；（155，55～300）/105細(xì)胞，ln aCECs（4.6±1.6）；（240，70～680）/105細(xì)胞，ln aCECs（5.2±1.8），治療后較基線升高差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。非PD病例平均治療3個(gè)周期，治療前、后aCECs變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.5 aCECs與TTP的相關(guān)性 相關(guān)性研究顯示，在聯(lián)合組中治療后aCECs的變化差值與TTP間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.351，P=0.039），而化療組兩者間無任何相關(guān)性（r=-0.205，P=0.372，圖2）。Cox回歸結(jié)果顯示aCECs的差值是反映聯(lián)合組TTP的重要因素（表1）。

圖2 aCECs差值與TTP的相關(guān)性Figure 2 Correlation between△aCECs and TTP

3 討論

晚期NSCLC患者的治療以化療為主，但雙藥含鉑方案平均生存時(shí)間僅為7～9個(gè)月，而且腫瘤復(fù)發(fā)仍難以避免［6］?？寡苌伤幬锱c化療聯(lián)合首次將其平均生存期延長至1年以上［7］。其中，血管內(nèi)皮抑素作用效果最為確切，多個(gè)臨床試驗(yàn)已證明其對雙藥聯(lián)合化療有明顯的增效作用［8］。但此類藥物的靶點(diǎn)是腫瘤血管，在短時(shí)間內(nèi)多無法迅速縮小腫瘤體積，單靠測量腫瘤大小往往會(huì)低估藥物的療效，臨床急需尋找有效的早期標(biāo)志物，以盡早評價(jià)腫瘤對抗血管治療的反應(yīng)。本研究組對此問題進(jìn)行了研究，并初步推測aCECs在抗血管生成療效的評判中具有重要價(jià)值。

表1 aCECs差值與NSCLC患者TTP間的相關(guān)性Table 1 Correlation between△aCECs and TTP

3.1 aCECs的流式檢測標(biāo)記

CECs是外周血中可檢測到的血管內(nèi)皮細(xì)胞總稱，在正常人血中含量極少，但在炎癥、免疫應(yīng)答、腫瘤等疾病狀態(tài)下數(shù)量明顯增加。CECs起源于現(xiàn)有血管壁的成熟內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞，以及由腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的有功能的內(nèi)皮細(xì)胞。成熟的CECs經(jīng)促血管生成因子激活后，進(jìn)入血液循環(huán)并轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨軆?nèi)皮細(xì)胞（activated CECs，aCECs），遷移至腫瘤處參與形成新生血管。aCECs升高可直接反應(yīng)促血管與抗血管生成因子的對抗平衡，監(jiān)測其水平可能有助于預(yù)測抗血管生成療效［9-10］。本研究組曾應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中的aCECs，將CD45-CD146+CD105+作為其界定標(biāo)志［4-5，9］。本研究表明，與健康對照者比較，以CD45-CD146+CD105+界定的aCECs在肺癌患者中明顯升高，初步驗(yàn)證了本研究前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)所確定的aCECs標(biāo)記的可靠性。

3.2 aCECs在治療中的動(dòng)態(tài)變化

aCECs的動(dòng)態(tài)變化一直存在爭議。Beuadry等［1］研究VEGFR抑制劑ZD6474時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZD6474可以使CECs升高，同時(shí)微血管密度下降、瘤體減小。Li等［11］發(fā)現(xiàn)經(jīng)沙利度胺聯(lián)合多西紫杉醇治療后，前列腺癌中凋亡CECs和aCECs均表現(xiàn)升高趨勢。Kawaishi等［12］觀察到經(jīng)紫杉醇聯(lián)合卡鉑治療后肺癌患者第8天及第22天aCECs較治療前下降。本研究組觀察到化療聯(lián)合恩度治療非小細(xì)胞肺癌有效病例中aCECs的數(shù)目顯著下降［9］。故在有效的抗血管生成聯(lián)合化療過程中，aCECs應(yīng)呈現(xiàn)“先升后降”的數(shù)量變化趨勢。首先，恩度抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），使腫瘤血管基底膜降解減少、血管通透性下降，降低局部組織間質(zhì)液壓，使膨脹的血管收縮，血管內(nèi)壁上的內(nèi)皮細(xì)胞被“擠脫”下來于血循環(huán)中，致使aCECs數(shù)目升高。隨后，細(xì)胞毒藥物誘導(dǎo)aCECs凋亡，而隨著腫瘤體積縮小，腫瘤血管生長因子（TAFs）及aCECs越來越少。因此aCECs開始的升高反映了腫瘤血管床面積的縮小，最終的下降則提示CECs凋亡和腫瘤新生血管能力的削弱。本研究化療組和聯(lián)合組治療中aCECs均有升降，說明CECs在治療中始終處于動(dòng)態(tài)升、降狀態(tài)，正是“血管正?；睂?dǎo)致其上升和誘導(dǎo)凋亡導(dǎo)致其下降動(dòng)態(tài)的平衡表現(xiàn)［13］。有研究提出，“血管正?；弊饔脙H出現(xiàn)于抗血管生成治療后的1～2周，是一過性的，后面即轉(zhuǎn)入抑制腫瘤血管而導(dǎo)致其退縮和“血管缺乏化”［14-15］。本研究認(rèn)為，由于治療中的多次、周期性用藥，兩種作用應(yīng)是交替共存的，治療有效者的aCECs也表現(xiàn)為下降中的反復(fù)波動(dòng)。而隨著治療延長，腫瘤細(xì)胞生物活性不斷降低、TAFs減少，瘤內(nèi)血管床面積和CE-Cs也會(huì)最終明顯降低并穩(wěn)定。

3.3 aCECs與療效的關(guān)系

本研究中化療組及聯(lián)合組PD患者治療后aCECs數(shù)量均較治療前升高（P=0.041，P=0.020），其差值的變化方向（上升或下降）與幅度可以反映療效的優(yōu)劣。有效治療使腫瘤縮小、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，aCECs必然最終下降。反之，若治療無效，新血管不斷生長，aCECs也會(huì)不斷升高。對其一過性的升高或降低需結(jié)合臨床及CT檢查結(jié)果評價(jià)，適時(shí)調(diào)整治療方案。相關(guān)性研究顯示聯(lián)合組aCECs治療前、后的變化差值與TTP間呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.351，P=0.039），提示經(jīng)過長時(shí)間的有效治療后，aCECs最終將會(huì)下降并保持在較低水平。

綜上所述，在晚期NSCLC患者的外周血中可以檢測到aCECs，在腫瘤進(jìn)展時(shí)其呈持續(xù)上升，而治療有效時(shí)則呈波動(dòng)下降趨勢，對此部分病患者繼續(xù)治療可獲得長期腫瘤穩(wěn)定。短時(shí)間內(nèi)的“血管正?；笨梢餋ECs的一過性升高。aCECs有望用于判定NSCLC抗血管生成聯(lián)合化療效果。

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