鄭 軍 謝貴元 李 姣 羅佳娣 文秋元 范松青

肺癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌占肺癌80%～85%。盡管手術(shù)和放化療技術(shù)不斷提高，但非小細(xì)胞肺癌患者的5生存率仍低于20%［1-3］。近年來以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點(diǎn)的分子靶向治療已成為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）一種新的治療方案，然而只有部分患者對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）Gefitibib和Erlotinib藥物敏感。研究證實(shí)：EGFR體細(xì)胞突變對Gefitibib和Erlotinib藥物治療后的潛在臨床反應(yīng)起決定作用，EGFR TKI結(jié)構(gòu)域的前4個(gè)外顯子（外顯子18～21）發(fā)生突變的患者對Gefitibib和Erlotinib藥物的反應(yīng)性更好［4-6］。本研究檢測NSCLC患者EGFR基因突變情況，旨在探討EGFR突變與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系，為后續(xù)臨床的個(gè)體化靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

標(biāo)本來源于湘雅二醫(yī)院病理科2010年1月至2012年12月期間經(jīng)肺穿刺（146例）和外科手術(shù)切除（68例）的214例非小細(xì)胞肺癌患者，全部病例術(shù)前未經(jīng)放化療。其中男性114例、女性100例，年齡≥60歲為96例、＜60歲為118例，WHO病理組織學(xué)分型：肺腺癌185例，鱗狀細(xì)胞癌29例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，取得患者同意，符合倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每一標(biāo)本從石蠟包埋的腫瘤組織中切取5～6 μm厚的切片，5～10片放入1.5 mL Eppendorf管中，加適量二甲苯進(jìn)行脫蠟，然后加入適量乙醇洗脫二甲苯，室溫或37℃晾干，直到乙醇完全蒸干；加入180 μL Buffer ATL，再加入20 μL蛋白酶K，震蕩混勻；56℃消化過夜，直至樣品完全裂解；用OIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒提取DNA。

1.2.2 基因突變檢測 利用ADx-ARMS?試劑盒（廈門艾德）進(jìn)行EGFR基因突變檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

EGFR基因位點(diǎn)的陽性突變率與肺癌臨床病理特征的相關(guān)性，利用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變分析

突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變。214例非小細(xì)胞肺癌EGFR基因總突變率為45.8%（97/214）。其中外顯子18突變率為0.93%（2/214）、外顯子19突變?yōu)?2.0%（47/214）、均為缺失突變；外顯子20突變率為2.3%（5/214），其中4例為缺失突變，1例EGFR基因T790M突變；外顯子21突變率為20.6%（44/214），均為EGFR基因L858R突變；另有2例患者為EGFR基因外顯子19和21雙重突變（表1）。

2.2 EGFR基因突變情況與患者臨床病理特征的關(guān)系

EGFR基因在肺腺癌組織中的突變率為50.3%（93/185）明顯高于肺鱗狀細(xì)胞癌17.2%（5/29）（P=0.001）；EGFR基因在女性患者中的突變率57.0%（57/100）高于男性36.0%（41/114）（P=0.002）；EGFR基因突變率與患者的年齡無顯著性差異（表2）。

本研究進(jìn)一步分析68例手術(shù)切除的NSCLC的EGFR基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和肺癌臨床分期的關(guān)系。EGFR基因在NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的突變率（66.7%）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（39.5%）（P＜0.05），但EGFR基因突變率與NSCLC患者腫瘤分化程度及臨床分期均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表1 214例非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變分析Table 1 Analysis of EGFR gene mutations in 214 cases of NSCLC

表2 EGFR基因突變與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Association between the EGFR gene mutations and clinicopathological features of NSCLC

表3 EGFR基因突變與68例手術(shù)切除非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Association between the EGFR gene mutations and clinicopathological features in 68 cases of surgically resected NSCLC

3 討論

EGFR是一種跨膜受體型酪氨酸激酶，在NSCLC中存在過表達(dá)和（或）發(fā)生突變。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib為進(jìn)展期NSCLC的臨床一線用藥，肺癌患者EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）靶向治療的一個(gè)必要前提條件［4-5］。目前，突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（ARMS）已成為國際上腫瘤個(gè)體化分子檢測最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢已被業(yè)內(nèi)專家廣泛認(rèn)可。ARMS技術(shù)利用特異引物對突變靶序列進(jìn)行高精準(zhǔn)PCR擴(kuò)增放大，與此同時(shí)，利用探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺上實(shí)現(xiàn)對樣品DNA中稀有突變的檢測，以達(dá)到對基因突變檢測的高特異性和高靈敏度。ARMS方法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法。

EGFR基因突變主要在亞洲、腺癌、女性、非吸煙者占優(yōu)勢，與Gefitinib靶向治療NSCLC患者的臨床療效分布相似［4］。本研究結(jié)果顯示，國內(nèi)NSCLC患者EGFR基因的總突變率（45.8%）與日本、中國臺灣及印度地區(qū)相接近，明顯高于西方人群［6-8］。腺癌是NSCLC最常見的組織類型，本研究中肺腺癌EGFR基因突變率為50.3%（P=0.001），高于韓國［9］（36.4%）和對中國大陸1 195例患者評估中肺腺癌EGFR基因突變的檢出率（38.1%）［10］。這可能與ARMS方法檢測靈敏度高，而且可以對原來未能檢測出陽性結(jié)果的小樣本增加檢出率有關(guān)。性別是NSCLC中EGFR基因突變的臨床預(yù)測因素之一，本研究結(jié)果與亞洲和西方國家的研究報(bào)道相一致，女性同樣有較高的突變率［6-10］。本研究進(jìn)一步證實(shí)亞洲腺癌患者和女性非小細(xì)胞肺癌EGFR的突變率總體較高，是EGFR-TKI靶向治療的優(yōu)先人群。

EGFR基因共28個(gè)外顯子，其中編碼酪氨酸激酶區(qū)的是第18～21外顯子。研究表明EGFR基因突變部位分散在整個(gè)酪氨酸激酶區(qū)，19外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R突變是最常見的突變類型［4-6］。本研究結(jié)果顯示這2個(gè)外顯子的突變率累計(jì)為42.6%。提示19外顯子和21外顯子易受環(huán)境致癌物的攻擊，突變后可能進(jìn)一步激活EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要的作用。此外，研究中還觀察到2例19外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R突變的雙重突變，這一現(xiàn)象提示肺癌患者中也存在EGFR基因聯(lián)合突變的發(fā)生。同時(shí)觀察到5例罕見的20外顯子突變，突變后可能改變了酪氨酸激酶區(qū)ATP結(jié)合囊的構(gòu)象，從而增強(qiáng)了ATP與EGFR的親和性，使腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生抵抗性，這一突變主要見于EGFR-TKIs治療后復(fù)發(fā)者［9-13］。

藥物療效與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及腫瘤病理分級密切相關(guān)。多數(shù)研究報(bào)道顯示，EGFR基因在NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的突變率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，而與腫瘤臨床分期及病理分級無顯著性相關(guān)［14-16］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)EGFR基因在NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的突變率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，但EGFR基因突變率與NSCLC患者的腫瘤分化程度及臨床分期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示Gefitinib可能對EGFR基因突變的不同分化程度和不同臨床分期的肺癌患者有同樣的藥物療效，本結(jié)果需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，中國非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變率較高，肺腺癌是主要的突變類型。檢測EGFR外顯子19和21突變并結(jié)合臨床病理特征有望成為評估TKI治療NSCLC患者療效的分子標(biāo)志。

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