周曉紅 唐 力 齊亞靈

放療在肺癌、食管癌等胸部惡性腫瘤的治療中占有重要的地位，在胸部腫瘤的放射治療過程中正常肺組織不可避免的受到一定劑量的照射，放射性肺損傷成為影響胸部腫瘤放射治療療效的主要劑量限制性因素之一，也是影響胸部腫瘤放療患者生存質(zhì)量的重要原因，因此放射性肺損傷的防治尤顯重要。活血化瘀中藥對放射性肺損傷的預防作用目前得到一定的證實［1-2］。參芎葡萄糖注射液為丹參和川芎嗪組方，其中丹參具有抗血小板聚集、改善肺內(nèi)微循環(huán)和增加肺血流量的作用；川芎嗪具有改善微循環(huán)、抑制炎癥介質(zhì)釋放，本實驗觀察了中藥參芎葡萄糖注射液對放射性肺損傷的影響，并對大鼠血漿中

TNF-α及TGF-β的含量進行檢測，目的在于探究參芎葡萄糖注射液是否能夠防治放射性肺損傷并初步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備及試劑 全自動多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，ELEKTA直線加速器，TNF-α及TGF-β1 ELISA試劑盒（上海亞培生物科技有限公司）。參芎葡萄糖注射液（吉林四長制藥有限公司）。

1.1.2 動物 SPF級成年雌性SD大鼠105只大鼠，體重（200±14）g（長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司）飼養(yǎng)期間動物清潔飲食，不限量。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 W后分為7組：N組：生理鹽水1 mL/只/d；D組：參芎葡萄糖注射液1 mL/只/d；Z組：全胸單次照射20 Gy+生理鹽水1 mL/只/d；Z10組：全胸單次照射10 Gy+參芎葡萄糖注射液1 mL/只/d；Z15組：全胸單次照射15 Gy+參芎葡萄糖注射液1 mL/只/d；Z20a組：全胸單次照射20 Gy，4 W后大鼠腹腔注射參芎葡萄糖注射液1 mL/只/d；Z20b組：全胸單次照射20 Gy+參芎葡萄糖注射液1 mL/只/d。所有藥物均經(jīng)大鼠腹腔注射。于佳木斯市腫瘤醫(yī)院放療科加速器室進行實驗大鼠的肺組織照射，照射前加速器室用紫外線照射消毒。待照射大鼠應用10%水合氯醛0.3 mL/100g腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠仰臥于照射臺上。照射野范圍：照射野上界為大鼠前肢兩腋窩中點連線，照射野下界為劍突水平，照射面積為4 cm×4 cm，SSD：100。用6MV-X線全胸單次照射20 Gy 45只，15 Gy 15只，10 Gy 15只，劑量率300c Gy/min。照射完畢大鼠送回實驗室常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 取材及指標檢測 1）取材：各組大鼠分別于照射后2、4、6、8、10 W，5個時間點取材（3只/組），應用10%水合氯醛0.3 mL/100g腹腔注射麻醉，剪開胸腔，刺破心臟取血1 mL，采血管收集血液，自然凝固30 min，1 000×g，離心15 min，收集上清，-20℃冰箱凍存。取大鼠雙側(cè)肺組織，10%福爾馬林液固定。2）檢測指標：①一般指標：照射后大鼠的進食變化，體重變化，脫毛情況。②肺組織行HE染色，觀察病理變化。③ELISA法檢測血清中TNF-α和TGF-β1的數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 進食及體重變化

照射后大鼠很快出現(xiàn)厭食，體重增長緩慢，至照射后4 W平均體重：照射大鼠為（235±8.5）g，未受照射大鼠平均體重為（287±12.5）g，兩組比較，P＜0.05。于照射10 d部分大鼠出現(xiàn)照射區(qū)脫毛（40/105），見圖1。在單純照射組死亡2只大鼠，死亡時間為照射后4～6W。而其他各組均無死亡大鼠。

2.2 大體及病理變化

由圖2、3可見，照射組大鼠從第2 W出現(xiàn)肺組織體積變大，充血水腫。第4 W，部分大鼠肺組織表面出現(xiàn)點狀出血點，D組3只均出現(xiàn)點狀出血，Z20a組2/3出現(xiàn)，Z20b組2/3出現(xiàn)，Z15組2/3出現(xiàn)，Z10組未出現(xiàn)。照射后8 W，單純照射組肺組織體積略縮小，肺表面有白色缺血區(qū)域，給藥組大體較單純照射組缺血區(qū)域減小。照射8～10 W部分大鼠出現(xiàn)胸腔積液，具體結(jié)果見表1。HE染色結(jié)果（圖4、5）：2W后，單純照射組肺組織見急性炎癥改變，肺組織充血，肺泡內(nèi)見少量紅細胞，間質(zhì)見淋巴細胞浸潤。照射后4 W，單純照射組肺泡內(nèi)紅細胞增多，肺泡間隔增厚，可見淋巴細胞及纖維細胞。照射后8W，肺泡間隔增厚明顯，大量纖維細胞出現(xiàn)，肺泡腔減少。

2.3 放射性肺損傷結(jié)果見表1。

2.4 ELISA檢測結(jié)果

Z組：TGF-β1，TNF-α血清數(shù)值于照射第4W開始增高，并于第6W達到最高值，治療組Z10，Z15，Z20b也于第4W開始升高，但低于單獨照射組（P＜0.01），8～10W TGF-β1，TNF-α血清數(shù)值以上各治療組低于單獨照射組（P＜0.01）。Z20a與Z組數(shù)值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具體結(jié)果見表2。

圖1 照射后不同時間點大鼠脫毛情況Figure 1 Rat hair removal at different time points after irradiation

圖2 照射2W肺大體標本Figure 2 Gross lung specimen at 2W after irradiation

圖3 照射4W肺大體標本Figure 3 Gross lung specimen at 4Wafter irradiation

圖4 照射4W肺組織病理變化（H&E×400）Figure 4 The pathological changes of lung tissue at 4W after irradiation（H&E×400）

圖5 照射10W肺組織病理變化（H&E×400）Figure 5 The pathological changes of lung tissue at 10W after irradiation（H&E×400）

表1 放射后胸腔積液發(fā)生率Table 1 Incidence of pleural effusion after radiation

表2 各組TGF-β值,TNF-α值的情況（pg/mL）Table 2 TGF-β and TNF-α levels of each group(pg/mL)

3 討論

放射治療是胸部腫瘤的三大主要治療手段之一，通常療程為6～7W。胸部放射治療的主要并發(fā)癥為急性放射性肺炎及放射性肺纖維化，常發(fā)生在放射治療結(jié)束后3～6個月［3］。放射性肺損傷的發(fā)生具有多源性，是一個由多因素共同存在，互相影響，綜合調(diào)控的復雜過程，就其發(fā)病機制產(chǎn)生了多種學說理論，主要有肺泡Ⅱ型細胞損傷學說、自由基損傷學說、細胞因子介導學說等。許多細胞因子均被認為與放射性肺損傷密切相關(guān)［4］，主要可以分成兩類，一類是參與局部損傷和炎癥反應的因子，以TNF-α最為重要［5］。另一類是參與組織修復和器官纖維化的因子，以轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）最為重要。TGF-β1是一種多功能細胞因子，被公認為纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐，是關(guān)鍵性細胞因子。細胞間粘附分子ICAM-1等也參與調(diào)控的復雜過程［6-8］。因此可以通過檢測細胞因子的表達來預測和早期發(fā)現(xiàn)放射性肺損傷的發(fā)生［8-9］。

目前針對放射性肺損傷采用的治療原則是防大于治、防治結(jié)合。對于肺部有慢性基礎疾病患者，一方面在放療中根據(jù)個體特點制定合理規(guī)范的放射治療計劃，根據(jù)劑量體積直方圖（DVH）等相關(guān)參數(shù)調(diào)整照射野角度和個數(shù)、照射體積和劑量，盡量避免或減少不利因素［10］，美國放射腫瘤學協(xié)作組在一個前瞻性的研究中發(fā)現(xiàn)，V20的大小不僅與放射性肺炎的發(fā)生率相關(guān)，而且與放射性肺炎的嚴重程度明顯相關(guān)［11］?；颊咴谡丈涞揭欢▌┝亢髴皶r調(diào)整治療靶區(qū)，調(diào)整劑量，充分考慮自身免疫性疾病、吸煙、糖尿病以及全身狀況等因素在放射性肺纖維化中的作用等，目前發(fā)生急性放射性肺炎后主要應用腎上腺皮質(zhì)激素，輔以抗感染、吸氧、止咳、平喘等對癥治療。該方法雖然可以暫緩癥狀，但對肺纖維化療效不佳且副作用較大，不宜行預防給藥或長期使用，其他藥物如秋水仙堿、阿米福汀及細胞因子抑制劑等的治療均有報道［12-13］；另一方面在放射治療前和放射治療過程中采用清熱解毒，養(yǎng)陰清肺，活血化瘀等方法預防或減輕放射性肺損傷［14］。中藥治療也有報道，如有研究顯示在給肺纖維化模型大鼠腹腔注射當歸提取液后，病理切片顯示當歸治療后肺泡炎及肺間質(zhì)纖維化明顯減輕［15］，其機理尚未完全明確。參芎葡萄糖注射液為丹參和川芎嗪組方，其中丹參具有抗血小板聚集、改善肺內(nèi)微循環(huán)和增加肺血流量的作用；川芎嗪具有改善微循環(huán)、抑制炎癥介質(zhì)釋放，抑制纖維母細胞亢進的膠原合成作用。因此本實驗在放療開始時同時大鼠腹腔注射參芎葡萄糖注射液，實驗結(jié)果顯示，未用藥組照射后大鼠很快出現(xiàn)厭食，體重增長緩慢，脫毛等。照射組大鼠從第2W出現(xiàn)肺組織體積變大，充血水腫。第4W，部分大鼠肺組織表面出現(xiàn)點狀出血點，D組均出現(xiàn)點狀出血，Z20a組2/3出現(xiàn)，Z20b2/3出現(xiàn)，Z15組2/3出現(xiàn)，Z10組0/3出現(xiàn)。照射后8W，單純照射組肺組織體積略縮小，肺表面有白色缺血區(qū)域，給藥組大體較單純照射組缺血區(qū)域減小。照射8～10W間有部分大鼠出現(xiàn)胸腔積液。HE結(jié)果顯示，2W后，單純照射組肺組織見急性炎癥改變，肺組織充血，肺泡內(nèi)見少量紅細胞，間質(zhì)見淋巴細胞浸潤。照射后4W，單純照射組肺泡內(nèi)紅細胞增多，肺泡間隔增厚，見淋巴細胞及纖維細胞。照射后8W，肺泡間隔增厚明顯，大量纖維細胞出現(xiàn)，肺泡腔減少。ELISA結(jié)果顯示，單獨照射組血清中TNF-α和TGF-β1因子的含量明顯高于各給藥組。實驗結(jié)果提示，參芎葡萄糖注射液能預防放射性肺損傷的發(fā)生，減輕肺炎的急性滲出，充血水腫等病理改變，機理與該藥物能降低血漿TNF-α和TGF-β1值有關(guān)；發(fā)生放射性肺炎后給藥能減緩癥狀，但不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的肺炎病理變化。

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