姚榮欣，李欠欠，林穎，周謝敏，包云華

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325027；2.耶魯大學醫(yī)學院 病理科，New Haven，Connecticut，06520）

細胞因子白細胞介素-11（IL-11）由人類骨髓基質細胞及間質細胞分泌產生，近年來，國內外有報道使用IL-11治療免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）取得了較好的效果[1-6]，但其機制不明。本研究觀察ITP患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在體外加入IL-11培養(yǎng)后Th1、Th2細胞比例及T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的改變，探討IL-11治療ITP的作用機制。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2011年6月-2012年8月在本院住院的ITP患者10例，均符合下列條件：首次發(fā)病者院外未應用過丙種球蛋白、糖皮質激素；ITP復發(fā)者近半年未應用糖皮質激素；近4周無感染及其他急慢性疾??；無過敏和免疫性疾病史及家族史。其中男4例，女6例，平均年齡（32.8±9.4）歲。

1.2 試劑與儀器 IL-11（巨和粒）購自山東齊魯制藥廠；CD3 PerCP、IL-4 PE、IFN-γAPC、CD8 FITC、IGG1 PE、IGG1 APC、CD69 PE（BD Biosciences，美國）；BFA、PMA、離子霉素（Sigma，美國）；人淋巴細胞分離液（TBD，天津）；胎牛血清（四季青，杭州）；RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco，美國）；Trizol（Invitrogen，美國）；MBI RT試劑盒（Fermentas，加拿大）；Roche SYBR Green I染料（Roche，瑞士）；BD FACS Canto II流式細胞儀（BD Biosciences，美國）；Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）；酶標儀（Tecan，瑞士）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PBMC分離：無菌抽取每例ITP患者外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，用PBS液1:1稀釋后，用密度梯度離心法分離PBMC，錐蟲藍染色法測定細胞活率大于95%。

1.3.2 加IL-11后細胞培養(yǎng)：PBMC用培養(yǎng)液調整細胞濃度（分別加入100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素+100 U/mL IL-2）至6×107個細胞/mL，各取1 mL分裝于6孔板內中，編號1、2、3、4、5，分別加入IL-11 0、25、50、100及200 ng。放入37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱內，培養(yǎng)4 d，錐蟲藍染色法測定細胞活率大于95%。

1.3.3 Th1、Th2細胞測定：將培養(yǎng)4 d后每孔細胞懸液分別取培養(yǎng)液200 L，用流式細胞儀測CD4+T細胞Th1細胞、Th2細胞比例。采用CD3與CD8反射門選取CD4+T細胞，即以CD3+CD8-IFN-γ+（APC標記IFN-γ）標記Th1，以CD3+CD8-IL-4+（PE標記IL-4）標記Th2，因Th1、Th2分群不明顯，應用CD3+CD8-IFN-γ-及CD3+CD8-IL-4-作為陰性對照，設定細胞計數小于0.1%作為陰性閾值，在陰性閾值基線基礎上計數CD3+CD8-IFN-γ+細胞及CD3+CD8-IL-4+細胞。采用流式細胞術檢測淋巴細胞群中Th1、Th2細胞所占百分比，并計算Th1細胞與Th2細胞比值（Th1/Th2）。

1.3.4 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA檢測：培養(yǎng)4 d后每孔細胞懸液取1×106，采用Trizol試劑提取總RNA，采用Tecan酶標儀測量其濃度和純度，用瓊脂凝膠電泳檢測RNA的完整性。取總RNA 1μg反轉錄為cDNA。用SYBR Green I染料檢測T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達情況。引物序列見表1，以GAPDH作為內參基因，每個標本分別進行T-bet、GATA-3、GAPDH的檢測。反應條件：熱啟動95 ℃ 5 min；擴增（95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，60 ℃采集熒光信號一次）連續(xù)45個循環(huán)；熔解95 ℃ 15 s，65 ℃15 s，升溫到95 ℃的同時連續(xù)檢測熒光信號。每個標本重復設3個副孔。所有的PCR產物均經熔解曲線分析以分辨目的產物與非特異產物以及引物二聚體。質控：加一個空白管，用雙蒸水替代cDNA。以Target/Ref進行相對定量，即分別以T-bet/GAPDH和GATA-3/GAPDH表示T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達量。并計算T-bet mRNA與GATA-3 mRNA的比值。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0軟件作數據處理。檢測指標以 ±s描述，多組間均數比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD4+T細胞Th1、Th2流式細胞儀測定結果 ITP患者PBMC加入不同濃度的IL-11培養(yǎng)后，對各組間Th1、Th2比例及Th1/Th2分別進行單因素方差分析（方差齊性檢驗P＞0.1），結果顯示P均小于0.05，說明不同濃度IL-11對Th1、Th2比例及Th1/Th2比值的影響作用差異具有統(tǒng)計學意義。

當IL-11濃度為100 ng/mL時，與濃度為0的對照組比較差異最大，表現(xiàn)為Th1比例及Th1/Th2比值下降，Th2比例升高（均P＜0.01）。具體數值見表2。

表2 各組Th1、Th2及Th1/Th2測定結果（n=10， ±s）

2.2 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA RT-PCR測定結果

提取mRNA反轉錄擴增后進行凝膠電泳檢查，瓊脂凝膠電泳分析條帶明亮，無雜帶，說明基因完整。目的基因T-bet mRNA、Gata-3 mRNA及內參基因GAPDH mRNA進行PCR擴增后可見3個副孔重復性好，曲線上升期明顯，拐點清楚，基線平，可見平臺期，表明擴增良好。擴增產物熔解曲線均為單峰，說明引物良好，提取的mRNA完整。

對各濃度組間T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3分別進行單因素方差分析（方差齊性檢驗P＞0.1），結果顯示P均小于0.05，說明不同濃度IL-11對T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3的影響作用差異具有統(tǒng)計學意義。

當IL-11濃度為100 ng/mL時，與濃度為0的對照組相比，T-bet mRNA表達下降，GATA-3 mRNA表達增加，T-bet/GATA-3比值顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。具體數值見表3。

表3 各組T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3檢測結果（n=10， ±s）

3 討論

IL-11主要由間充質來源的黏附細胞產生，具有多種生物活性，在免疫調節(jié)、造血調控方面具有重要作用。目前的研究認為IL-11能促進Th1細胞向Th2亞群分化[7-10]。

CD4+的T細胞在抗原的刺激下，分化為中間狀態(tài)的Th0細胞，進而在不同的微環(huán)境條件下，分化為Thl和Th2類細胞。由于Th1、Th2細胞缺乏特異的細胞表面抗原標記，目前一般通過檢測Th1、Th2細胞分泌的細胞因子IFN-γ、IL-4水平來作為其各自的表達量。本實驗通過流式細胞儀以CD3、CD8反射門選取CD4+T細胞，Thl細胞應用IFN-γ APC熒光抗體標記，Th2細胞應用IL-4 PE熒光抗體標記，通過測定CD4+T細胞中IFN-γ、IL-4來確定Thl、Th2細胞百分率。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC在加入IL-11培養(yǎng)后，Th1細胞比例下降，Th2細胞比例升高，Th1/Th2比值下降，這種現(xiàn)象在IL-11濃度為100 ng/mL時最為明顯，表明IL-11在體外培養(yǎng)條件下能促使ITP患者PBMC由Th1細胞極化向Th2細胞極化漂移。作為自身免疫性疾病，成人慢性ITP具有特異表達Th1極化以及Th1型細胞因子IFN-γ水平升高現(xiàn)象[11-12]?，F(xiàn)有研究表明CD4+T細胞Th1/Th2細胞亞群比例失衡是ITP發(fā)病的機制之一[13-17]，由此我們推測，通過促使CD4+T細胞更多地由Th1細胞極化向Th2細胞極化漂移，從而糾正ITP患者體內存在的免疫失衡可能是IL-11在臨床上有效治療ITP的機制之一。

T-bet和GATA-3是調節(jié)Th1和Th2類細胞因子表達的兩個重要的轉錄調控因子[18-21]。T-bet是轉錄因子T-box家族成員之一，表達于包括骨髓、臍血祖細胞及干細胞在內的血細胞，主要為CD4+T細胞。T-et通過激活IFN-γ基因而發(fā)揮其對Th1細胞發(fā)育的正性調控作用，其高表達與Th1型細胞因子細胞的升高相符合。將T-bet基因反轉錄于成熟的Th2細胞能促使其轉化為分泌IFN-γ的Th1細胞，并同時抑制IL-4、IL-5等細胞因子的表達，因此，T-bet在促使Th0細胞向Th1細胞極化的同時明顯抑制了Th2細胞的極化[22]。T-bet的表達在Th1細胞發(fā)展的早期階段明顯增高，但是在Th2細胞的發(fā)育過程中并不表達。GATA-3是鋅指蛋白GATA家族的成員之一，在促進Th2細胞形成和抑制Th1細胞形成過程中起核心作用。CD4+T細胞僅表達低水平的GATA-3，當CD4+T細胞向Th2分化時該表達上調，而當CD4+T細胞向Thl分化時該表達下調，在成熟Thl細胞中則不能被測到，故GATA-3僅特異表達于Th2細胞。此外，GATA-3既可抑制Thl細胞分化，亦可促使其向Th2細胞的極化方向發(fā)生改變，GATA-3在促使Th0細胞向Th2細胞極化的同時抑制了Thl細胞的極化[23]。在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病中，可以觀察到T-bet上升和GATA-3下降現(xiàn)象[24-25]。

Chakir等[26]發(fā)現(xiàn)，在多種產生Th1樣和Th2樣細胞因子的細胞中，T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達上調，并且可以比較容易地從混合細胞群中提取總RNA，通過RT-PCR的方法測定，這提示T-bet/GATA-3可以在許多種情況下反映Th1/Th2細胞因子的平衡狀況。

我們采用RT-PCR技術，從轉錄水平上測定Th1、Th2細胞的調控因子T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)，當ITP患者的PBMC經IL-11培養(yǎng)后，T-bet mRNA表達下降，而GATA-3 mRNA表達增強，T-bet mRNA/GATA-3 mRNA比值下降。

綜上所述，我們分別通過流式細胞儀測定Th1、Th2細胞比例及Th1/Th2比值和RT-PCR方法測定Th1、Th2細胞的調控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達，從不同的角度表明，IL-11在體外能促使ITP患者CD4+T細胞從Th1極化優(yōu)勢向Th2極化優(yōu)勢轉化，這種轉化可能是通過其調控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA來控制的。這可能是IL-11有效治療ITP的機制之一。

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