盧徐漣，鄒阮敏，陳向敏，陳俊，張麗芳，薛向陽

（1.溫州醫(yī)科大學 微生物學與免疫學教研室、分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325000；3.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，浙江 溫州 325035）

宮頸癌是在全世界引起女性死亡的第二大癌癥。高危型HPV（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持續(xù)性感染，尤其是HPV16和HPV18，是引起宮頸癌的重要病因[1]。目前已明確HPV早期癌蛋白E6、E7與抑癌基因p53和pRb之間的E6-p53、E7-pRb調(diào)控模式在宮頸上皮細胞癌變過程中起著重要作用[2-3]；此外，E6、E7的表達還可引起宿主基因組的不穩(wěn)定[4]。HPV基因?qū)儆陔p順反子或多順反子，常存在轉(zhuǎn)錄后RNA剪切的過程，以消除轉(zhuǎn)錄本中非編碼的內(nèi)含子序列[5]。不同的RNA剪切方式可形成不同的轉(zhuǎn)錄模式，由此產(chǎn)生差異的編碼蛋白。另外，已證實宮頸細胞癌變過程中常存在HPV基因整合，而整合于宿主基因組的病毒基因由于受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的影響，會明顯改變病毒基因的表達。目前HPV E6基因轉(zhuǎn)錄的檢測主要通過普通PCR或Real-time RCR擴增，但是這些方法不能明確E6基因的完整轉(zhuǎn)錄本，為此，本研究旨在建立HPV16早期基因E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本檢測方法，以分析宮頸癌不同病變時期HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式的變化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 宮頸標本：留取溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院從2010年12月到2012年4月間婦科63例HPV16陽性宮頸腫瘤患者術(shù)后組織樣本和9例正常宮頸組織，患者年齡25～59歲，平均（42±0.75）歲。根據(jù)TBS診斷系統(tǒng)，63例腫瘤樣本中，低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）8例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）38例和宮頸癌17例。所有患者在術(shù)前均未進行放療、化療等治療，且均經(jīng)陰道鏡檢查。本研究使用的臨床樣本已經(jīng)由患者知情以及醫(yī)院倫理委員會同意。每例標本離體后10 min內(nèi)放入RNAlater并置于液氮中保存待后續(xù)實驗。

1.1.2 實驗試劑：RNAlater購于美國Ambion公司；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；Rnase-free Dnase I試劑盒購于大連Takara公司；RT-PCR試劑盒和KOD plus PCR試劑盒購于日本TOYOBO公司；硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜購自美國Bio-Rad公司；Southern檢測試劑盒（North2South Chemiluminescent Detection Kits）購自美國Thermo公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于北京天根生物科技有限公司；HPV16 E6特異性寡核苷酸探針及引物在上海生物工程有限公司合成。

1.1.3 細胞株：Caski細胞（人宮頸癌HPV16陽性），購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 方法

1.2.1 Caski細胞培養(yǎng)：人宮頸癌Caski細胞接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%濕度及體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代，每2～3 d傳代一次。

1.2.2 總RNA提取：取液氮保存的宮頸組織樣本，在液氮中碾碎至粉狀，按照Trizol試劑的說明書分離RNA。為了防止殘余DNA污染，按DNA消化試劑盒說明書去除DNA。提純后的RNA溶解在Rnase-free水中，并保存在-80 ℃環(huán)境中。用分光光度儀（德國EPPENDORF公司）檢測RNA溶液在紫外光波長為260 nm與280 nm的OD值，計算RNA的濃度和純度，同時用1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄以及HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的擴增：將1μg總RNA以RT引物（GACTCGAGTCGACATCGAT TTTTTTTTTTTTTTTT）進行反轉(zhuǎn)錄[6]。反應體系為20 μL，包括1μg RNA、1μL 50μmol/L RT、1μL Enzyme mix、4μL 5×buffer Nuclease free water。反應條件為：65 ℃，10 min打開RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)，接著加入反應緩沖液和反轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃，60 min，95 ℃，5 min，產(chǎn)物cDNA保存于-20 ℃環(huán)境。然后以cDNA為模板，用HPV16 E6特異性引物P1（CGACC CAGAAAGTTACCAC）和P0（GACTCGAGTCGACATCGA）作為PCR的前向、反向引物，采用50μL反應體系擴增HPV16 E6轉(zhuǎn)錄本。反應體系包括1.0 mmol/L MgSO4，0.2 mmol/L dNTPs， 0.2μmol/L前、反向引物和1.0單位高保真酶（KOD plus）。反應條件為：95 ℃，90 s預變性，94 ℃，30 s變性，59 ℃，30 s退火，68 ℃，2 min延伸，35個循環(huán)，68 ℃，6 min最終延伸，保證擴增片段的完整性。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 Southern Blotting技術(shù)檢測：取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過濕轉(zhuǎn)的方法將凝膠中的DNA充分轉(zhuǎn)移到NC膜上，80 ℃干燥2 h固定，加入適當?shù)碾s交液（以10 cm2膜面積加入1 mL雜交液），預雜交1 h，棄去，更換同體積的雜交液，同時加入HPV16 E6特異性寡核苷酸探針（終濃度10μmol/L）46 ℃雜交過夜（12～15 h）。雜交后，棄去雜交液加入50 ℃預熱的等體積高鹽離子濃度漂洗液（包含2×SSC和0.1% SDS），50 ℃震蕩漂洗20 min，重復一次。然后再用低鹽離子濃度漂洗液（包含0.2×SSC和0.1% SDS），53 ℃震蕩漂洗15 min，重復一次。接著按照North2South Chemiluminescent Detection Kits說明書的操作步驟標記探針與酶促發(fā)光，最后用膠片曝光。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E6早期基因轉(zhuǎn)錄本特異性擴增方法的建立 圖1是既往報道的HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式。由于宮頸癌發(fā)生過程常存在HPV基因整合，為分析HPV16 E6轉(zhuǎn)錄本，本研究利用含保守序列的RT引物將組織標本中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成5’端含保守序列的cDNA，并利用HPV16 E6特異性引物（P1）和保守序列（P0）進行PCR擴增，以達到擴增和克隆cDNA分子中的一個短序列及其未知的3’末端之間的區(qū)域[7]。這種設(shè)計不但可擴增游離型HPV16的E6轉(zhuǎn)錄本，而且可有效擴增整合型E6轉(zhuǎn)錄本。如圖2所示，HPV16陽性的Caski宮頸癌細胞及正常宮頸組織經(jīng)本方法擴增后，Caski細胞標本瓊脂糖電泳能檢測到目的條帶（見圖2A），而正常宮頸組織樣本未見擴增條帶（見圖2B），提示本方法能特異性擴增HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。

圖1 HPV16 E6相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式

圖2 HPV16 E6早期基因轉(zhuǎn)錄本特異性擴增方法特異性分析

2.2 宮頸癌發(fā)生發(fā)展不同階段HPV16 E6轉(zhuǎn)錄模式的差異分析 基于上述建立的方法，本研究系統(tǒng)分析HPV16陽性的LSIL、HSIL及宮頸癌組織中HPV16 E6的轉(zhuǎn)錄模式。如圖3所示，在LSIL樣本中，只檢測到少量的轉(zhuǎn)錄片段，常見的轉(zhuǎn)錄片段長度為250、500和1 000 bp，在HSIL樣本中，轉(zhuǎn)錄片段數(shù)量和種類明顯多于LSIL，主要的片段長度集中在250、650和1 000 bp以上的大片段，而在宮頸癌組織中，除轉(zhuǎn)錄片段的數(shù)量和種類增多以外，優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄片段更加明顯，主要集中在500和1 000 bp。隨著LSIL向?qū)m頸癌發(fā)展，HPV16 E6轉(zhuǎn)錄本片段種類增多，而且優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄模式逐漸清晰。Southern Blotting進一步證實了HPV16 E6轉(zhuǎn)錄模式在宮頸癌發(fā)生發(fā)展不同階段中的變化（見圖3）。另外，由于部分轉(zhuǎn)錄片段數(shù)量少，熒光雜交信號太弱，少量非特異性擴增不在探針序列的檢測范圍等原因，導致這些轉(zhuǎn)錄本在Southern Blotting技術(shù)檢測中無法顯示，如宮頸癌組織第5泳道的轉(zhuǎn)錄片段。

圖3 APOT法分析LSIL、HSIL和宮頸癌組織中HPV16 E6相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式

3 討論

HPV基因組是長度約7.9 kb雙鏈環(huán)狀DNA，可分為非編碼區(qū)LCR（long control region），早期基因區(qū)（編碼E1、E2、E4、E5、E6及E7 6個早期基因）和晚期基因區(qū)（編碼衣殼蛋白L1和L2）[5]。由于HPV基因組具多順反子特征，不同轉(zhuǎn)錄模式以及轉(zhuǎn)錄本的不同剪切模式常導致不同HPV基因表達[5]。此外，由于E6蛋白的穩(wěn)定性不高，目前普遍使用的蛋白實驗手段幾乎檢測不到。因此，要了解E6基因的表達只能基于基因的轉(zhuǎn)錄水平。

目前檢測HPV E6基因表達常根據(jù)E6序列設(shè)計引物進行RT-PCR或定量PCR檢測。這種檢測的缺陷在于僅檢測引物部分序列，無法明確E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本信息。理論上，采用Northern Blotting雜交檢測可彌補這種缺陷，但宮頸癌組織中E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本含量較少，限制其使用。本研究建立的方法是先對E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本進行PCR擴增后，再進行特異探針雜交，可極大提高檢測敏感性。目前也有不少研究者采用APOT的方法檢測游離型和整合型的病毒癌基因轉(zhuǎn)錄模式[8-10]，但這種兩輪擴增的巢式PCR的檢測方法存在一定局限。比如，它無法有效擴增由病毒基因和整合基因構(gòu)成的融合型長序列的轉(zhuǎn)錄本，因此檢測到的整合型轉(zhuǎn)錄本數(shù)量少于實際存在的數(shù)量[10]；另外，這種PCR檢測方法會傾向于擴增實際mRNA濃度高轉(zhuǎn)錄本數(shù)量多的轉(zhuǎn)錄模式而忽略較少數(shù)量的轉(zhuǎn)錄模式。因此，我們通過優(yōu)化檢測方法削弱高含量轉(zhuǎn)錄本的擴增優(yōu)勢，使檢測結(jié)果更客觀，同時，將兩輪PCR改成一輪，比原有的方法更方便簡潔。

盡管HPV16游離型感染的基因轉(zhuǎn)錄模式已經(jīng)闡明[5]，但在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中HPV基因組常整合入宿主細胞基因組，可改變HPV基因的轉(zhuǎn)錄模式[6]。既往的研究主要集中在E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄模式的變化，在HPV16陽性的宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)了游離型的E7-E1^E4和整合型的E7-E1^cellular DNA、E7-E1^E4-cellular DNA等多種E7相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式[6，11]。關(guān)于E6相關(guān)的轉(zhuǎn)錄，已經(jīng)證實，除外E6全長基因轉(zhuǎn)錄模式，HPV 16還可編碼E6*I和E6*II兩種E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本[5]。這兩種轉(zhuǎn)錄本均以E6 ORF中226位點作為剪切供體，但分別以HPV16基因組中409和526位點作為剪切受體位點。有研究提示，這兩種轉(zhuǎn)錄模式與促進E7表達有關(guān)[12-13]。在宮頸癌組織HPV16 E6的轉(zhuǎn)錄模式，目前也發(fā)現(xiàn)E6-E7-E1[9]、E6-E7-E1^E4、E6-E7-E1（E1完整）、E6-E7-E1（E1不完整）整合型的模式和E6-E7-E1^E4游離型的模式[9，11]，但HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性鮮見報道。

為分析宮頸癌發(fā)生不同階段的HPV16 E6相關(guān)的轉(zhuǎn)錄情況，本研究參考檢測E7相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的APOT方法[6]，建立了特異性擴增HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的方法。這種設(shè)計能有效擴增直接poly A結(jié)尾的E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，不但可用于檢測游離型HPV16的E6轉(zhuǎn)錄本，而且可有效檢測整合型E6轉(zhuǎn)錄本[9，11]。瓊脂糖凝膠電泳及Southern Blotting證實，我們建立的方法能有效檢測HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。

基于建立的HPV16 E6相關(guān)轉(zhuǎn)錄本檢測方法，我們檢測了63例HPV16陽性的宮頸病變組織（包括8例LSIL、38例HSIL及17例宮頸癌組織標本）中E6相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著LSIL向?qū)m頸癌發(fā)展，HPV16 E6轉(zhuǎn)錄本片段種類增多。但在所檢測的標本中都無法檢測到所有既往報道的轉(zhuǎn)錄模式。Van Tine等[14]認為，轉(zhuǎn)錄模式的選擇是一個動態(tài)的過程以應對變化的環(huán)境，從而達到最優(yōu)的基因表達模式使細胞增殖，這也許容易理解隨著細胞癌變程度的加深優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄模式逐漸清晰的原因。另外，基因轉(zhuǎn)錄后的可變剪切使病毒癌性基因的轉(zhuǎn)錄模式向著有利于腫瘤細胞增殖的方向發(fā)展也是導致轉(zhuǎn)錄模式在不同病變組織中存在差異的重要原因[5，12，15]。

HPV16早期基因轉(zhuǎn)錄模式在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用鮮見相關(guān)研究報道。目前已報道的檢測HPV的方法[16-21]敏感度不高，檢測引物的特異性有待增強[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV16早期基因轉(zhuǎn)錄模式在宮頸癌變各時期中存在很大差異，這為宮頸癌早期診斷治療和判斷預后提供了新思路。

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