盧 璐 孫文文 袁風(fēng)菊 楊開(kāi)顏

EB病毒是一種嗜人類(lèi)淋巴細(xì)胞的DNA病毒，屬于人類(lèi)皰疹病毒4型(γ－h(huán)erpesvirus)在全世界的感染率大于90%，大多數(shù)人終身EBV潛伏感染而無(wú)任何癥狀，少數(shù)情況下如機(jī)體免疫功能明顯下降時(shí)，免疫系統(tǒng)與病毒之間的平衡被打破，則可引起嚴(yán)重的相關(guān)性疾病，特別是良性或惡性的淋巴增殖性疾病。國(guó)內(nèi)外已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，EBV陽(yáng)性檢出率在不同地區(qū)，不同類(lèi)型的淋巴瘤之間存在差異［1，2］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)、原位雜交及PCR方法對(duì)惡性淋巴瘤中EBV感染進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討不同類(lèi)型的淋巴瘤中BEV的感染情況和3種檢測(cè)方法的差異性。

材料與方法

1．標(biāo)本:所有標(biāo)本均為2009年1月～2011年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為淋巴瘤的石蠟包埋組織57例，其中男性34例，女性23例，發(fā)病年齡25～90歲，中位發(fā)病年齡56．5歲。所有標(biāo)本的切片均經(jīng)2位以上病理專(zhuān)家重新閱讀，并按照WHO 2008年淋巴瘤新分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分型。結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤鼻型12例，血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T－cell lymphoma，AITCL)13例，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)12例，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)20例。

2．主要試劑:EBV LMP－1單克隆抗體工作液、免疫組織化學(xué)兩步法染色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Rembrant原位雜交試劑盒為PanPath公司產(chǎn)品，EBER 1管核苷酸探針為地高辛標(biāo)記，EBV及β－actin引物合成并訂購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

3．免疫組化檢測(cè)EBV Lmp－1:采用免疫組織化學(xué)兩步法，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。蠟塊按常規(guī)切片厚4μm，脫蠟，抗原高壓修復(fù)后用一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜，再用二抗37℃孵育30min，DAB顯色，并用蘇木素復(fù)染。PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。Lmp－1陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。結(jié)果按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分別記錄，無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(－)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1% ～25%為弱陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26% ～50%為中等陽(yáng)性(++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51% ～75%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥75%為極強(qiáng)陽(yáng)性(++++)。

4．原位雜交檢測(cè)EBER1 mRNA表達(dá):原位雜交具體步驟簡(jiǎn)述如下:①石蠟切片脫蠟，無(wú)水乙醇5min，自然干燥;②胃蛋白酶 37℃濕盒消化 30min，梯度乙醇脫水(70%、95%、100%)，自然干燥;③雜交，滴加探針并加蓋玻片，放置濕盒中55℃恒溫箱孵育60min，37℃濕盒孵育過(guò)夜。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同免疫組化。

5．PCR方法檢測(cè)EBV DNA的表達(dá):首先是模板DNA的提取，切10μm厚石蠟切片5～10張，脫蠟清洗干燥后，用蛋白酶消化過(guò)夜，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增:β－actin引物上游為5'－CCACACTGTGCCCATCTACG －3'，下游為 5'－AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG－3'，目的片段長(zhǎng)度為99bp。EBV引物上游為5'－CCAGACAGCAGCCAATTGTC－3'，下游為5'－GGTAGAAGACCCCCTCTTAC －3'，目的片段長(zhǎng)度為 123bp。PCR反應(yīng)體系為在0．2ml去酶EP管中依次加入2×PCR MIX 10μl、上游引物 1μl(10pmol/μl)、下游引物 1μl(10pmol/μl)、DNA 1μl、ddH2O 7μl?？偡磻?yīng)體積為 20μl。PCR 反應(yīng)體系參數(shù):根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及參考文獻(xiàn)，確定退火溫度(Tm值)及循環(huán)數(shù):94℃預(yù)變性3min;94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 45s，循環(huán)40次;72℃終末延伸10min。最后是瓊脂糖凝膠電泳，取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，溴化乙錠(1μg/μl)染色，用條帶凝膠圖像分析系統(tǒng)觀(guān)察、照相。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)不同類(lèi)型淋巴瘤EBV表達(dá)差異、不同檢測(cè)方式的比較及兩兩之間比較均采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．免疫組化檢測(cè)結(jié)果:57例淋巴瘤中總陽(yáng)性表達(dá)率為 17.5%(10/57)，13例 AITCL中 4例(30.8%)表達(dá)陽(yáng)性，其中2例為“+”2例為“++”，12例NK/TCL中1例(8．3%)表達(dá)陽(yáng)性為“++”，12例HL中4例(33．3%)表達(dá)陽(yáng)性，3例為“++”，1例為“+”，20例 DLBC 中1例(5．0%)陽(yáng)性為“++”。4種類(lèi)型淋巴瘤的EBV LMP－1的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。

圖1 EBV LMP－1在不同類(lèi)型淋巴瘤中陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×400)

2．原位雜交結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)57例淋巴瘤總陽(yáng)性表達(dá)率為 47．4%(27/57)，12例 NK/TCL中有 10例(83．3%)表達(dá)陽(yáng)性，其中1例為“++++”，6例為“+++”，3例為“++”。13例 AITCL中有6例(46.2%)表達(dá)陽(yáng)性，6例均為“+”。12例HL中有5例(41．7%)表達(dá)陽(yáng)性，5例均為“+”。20例DLBCL中，5例表達(dá)陽(yáng)性(25．0%)，4例為“+”，1例為“++++”，此1例為器官移植后彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤。4種類(lèi)型淋巴瘤的EBER1表達(dá)情況見(jiàn)圖2。

圖2 EBER1 mRNA在不同類(lèi)型淋巴瘤中陽(yáng)性表達(dá)(ISH，×400)

3．PCR檢測(cè)結(jié)果:57例淋巴瘤中EBV總陽(yáng)性表達(dá)率為 50．9%(29/57)，12例 NK/TCL中 11例(91.7%)表達(dá)陽(yáng)性，13例AITCL中8例(61．5%)表達(dá)陽(yáng)性，12例HL中6例(50．0%)表達(dá)陽(yáng)性，20例DLBCL中5例表達(dá)陽(yáng)性(25．0%)，表達(dá)強(qiáng)弱有所不同。PCR檢測(cè)EBV感染淋巴瘤的表達(dá)情況見(jiàn)圖3。

圖3 EBV DNA在不同淋巴瘤中的表達(dá)

4．不同類(lèi)型淋巴瘤與EBV感染的關(guān)系及3種檢測(cè)方法的比較:EBV在T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)高于B細(xì)胞淋巴瘤與霍奇金淋巴瘤(P＜0．05)，NK/TCL中的表達(dá)高于霍奇金淋巴瘤和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(P＜0．05)，AITCL中高于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，而結(jié)外NK/TCL與AITCL、AITCL與 HL、HL與 DLBCL之間表達(dá)差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。在3種EBV檢測(cè)方法中，PCR及ISH優(yōu)于IHC(P＜0．05)，而PCR與ISH之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

討 論

Epstein－Barr病毒(EBV)是 Epstein和 Barr于1964年在Burkitt淋巴瘤標(biāo)本的體外傳代細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，具有嗜淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞的特性。在細(xì)胞外成熟的病毒顆粒為球形，直徑為150～180nm，EBV病毒基因是線(xiàn)性雙鏈DNA，基因組長(zhǎng)平均為172kb。EBV以潛伏感染最為常見(jiàn)，人群普遍易感。EBV可長(zhǎng)期潛伏在被感染的B細(xì)胞內(nèi)，形成持續(xù)的潛伏感染。其中僅極少數(shù)可發(fā)展為EBV相關(guān)的上皮細(xì)胞惡性腫瘤和淋巴瘤。本課題通過(guò)應(yīng)用3種方法檢測(cè)不同類(lèi)型淋巴瘤中EBV感染情況來(lái)探討EBV與不同類(lèi)型淋巴瘤的感染情況及3種檢測(cè)方法結(jié)果的差異性。

大量研究證明EBV與霍奇金淋巴瘤及部分T、B細(xì)胞來(lái)源的非霍奇金淋巴瘤均有一定的關(guān)系。EBV感染與HL的關(guān)系較為密切，但各國(guó)所報(bào)道的HL中EBV的檢出率有很大的差異，日本為65%，墨西哥為67%。秘魯為94%，肯尼亞為92%。意大利為4l%，美國(guó)為50%左右［3］。本實(shí)驗(yàn)HL中EBV DNA的陽(yáng)性表達(dá)率為50．0%，在我國(guó)報(bào)道的48% ～57%范圍內(nèi)［4］。很多年來(lái)一直認(rèn)為EBV感染僅與B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病有關(guān)，但越來(lái)越多的研究表明，在非霍奇金淋巴瘤中，EBV陽(yáng)性的T細(xì)胞淋巴瘤遠(yuǎn)較EBV陽(yáng)性的B細(xì)胞淋巴瘤多，尤其是NK/TCL和AITCL［5］。其中AITCL中EBV檢出率為75%，有學(xué)者報(bào)道EBV在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中DNA檢出率為69．66%，但EBV在B細(xì)胞淋巴瘤中的檢出率僅為5%～8%左右［6～8］。本研究對(duì)4種淋巴瘤做了初步研究和闡述，通過(guò)PCR數(shù)據(jù)分析顯示EBV在NK/TCL和AITCL中表達(dá)偏高，而在HL和DLBCL中表達(dá)偏低，而AITCL與HL陽(yáng)性率雖有差異，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明EB病毒感染在不同類(lèi)型的淋巴瘤中的存在著一定的差異性，對(duì)臨床是否把抗EBV治療作為治療某種類(lèi)型淋巴瘤的必要手段有一定的參考價(jià)值。筆者將收集更多的標(biāo)本對(duì)不同類(lèi)型淋巴瘤與EBV的關(guān)系作進(jìn)一步的研究。

研究表明，EBV陽(yáng)性的NK/TCL淋巴瘤患者生存率明顯低于陰性患者，故對(duì)EBV感染的檢測(cè)至關(guān)重要［9，10］。EBV 的檢測(cè)方式主要有免疫組化、原位雜交及聚合酶鏈反應(yīng)，而3種檢測(cè)方法原理不同，故檢測(cè)結(jié)果存在一定的差異性。免疫組化檢測(cè)方法中LMP－1為胞質(zhì)及胞膜著色，只能說(shuō)明被感染細(xì)胞中EBV的蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)不出病毒的定位和轉(zhuǎn)錄數(shù)量。但該方法具有操作簡(jiǎn)單、方便、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。原位雜交檢測(cè)EBER被認(rèn)為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中EBV的金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度高，特異性強(qiáng)，EBER1染色為胞核著色，結(jié)果清晰，容易辨認(rèn)，反映的是DNA轉(zhuǎn)錄情況，但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)(36～40h)，過(guò)程較為繁瑣［11］。PCR從DNA水平檢測(cè)，其敏感度比免疫組化和原位雜交高，對(duì)樣本要求低，但PCR檢測(cè)成本高且其特異性略差，結(jié)果易受各種不確定因素影響，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，有時(shí)需要多次重復(fù)才能得出可靠結(jié)果。3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，PCR與原位雜交方法敏感度比免疫組化高，這與國(guó)外研究結(jié)論一致，但免疫組化操作方便，因此臨床工作中可把免疫組化作為EBV的初篩方法［12］。本實(shí)驗(yàn) IHC、ISH、PCR 3種方法陽(yáng)性表達(dá)率分別為 17．5%、47．4%、50．9%，數(shù)據(jù)分析顯示PCR和ISH比IHC更為敏感，而PCR與原位雜交之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EBV陽(yáng)性是淋巴瘤的獨(dú)立不良預(yù)后因素，故EBV的檢測(cè)對(duì)于淋巴瘤的診斷、治療、及預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。檢測(cè)方法不同可能是導(dǎo)致各報(bào)道中惡性淋巴瘤EBV檢出率相差懸殊的原因之一。故建議在臨床病理診斷工作中盡量將3種方法結(jié)合，相互補(bǔ)充，以提高其檢出率。

EBV在全世界感染率非常高，尤其是在欠發(fā)達(dá)的國(guó)家，EBV活動(dòng)性感染以及EBV感染相關(guān)的淋巴瘤發(fā)病率更高，因此加強(qiáng)EBV感染的檢測(cè)和EBV陽(yáng)性淋巴瘤的治療是十分重要的。盡管關(guān)于EBV與淋巴瘤之間關(guān)系的研究已經(jīng)取得突破性進(jìn)展，如抗EBV疫苗，但仍然存在很多問(wèn)題。EBV感染所致淋巴瘤的內(nèi)在機(jī)制尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。

1 Trimeche M，Bonnet C，Korbi S，et al．Association between Epstein－Barr virus and Hodgkin's lymphoma in Belgium:a pathological and virological study［J］．Leuk Lymphoma，2007，48(7):1323 － 1331

2 Cho EY，Kim KH，Kim WS，et al．The spectrum of Epstein－Barr virus－associated lymphoproliferative disease in Korea:incidence of disease entities by age groups［J］．J Korean Med Sci，2008，23(2):185－192

3 Thompson MP，Kurzrock R．Epstein － Barr virus and cancer［J］．Clin Cancer Res，2004，10(3):803 －821

4 周小鴿．霍奇金淋巴瘤與EB病毒相關(guān)性研究進(jìn)展［J］．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，2(1):22 －27

5 Cohen JI，Kimura H，Nakamura S，et al．Epstein －Barr virus－associated lymphoproliferative disease in non－immunocompromised hosts:a status report and summary of an international meeting，8－9 September 2008［J］．Ann Oncol，2009，20(9):1472 －1482

6 Huh J，Cho K，Heo D S，et al．Detection of Epstein － Barr virus in Korean peripheral T － cell lymphoma［J］．Am J Hematol，1999，60(3):205－214

7 李開(kāi)智，浣孝強(qiáng)．89例鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤與EB病毒關(guān)系的研究［J］．天津醫(yī)藥，2008，36(5):343 －345

8 De Roos AJ，Martinez－ Maza O，Jerome KR，et al．Investigation of Epstein－Barr Virus as a potential cause of B－Cell non－Hodgkin lymphoma in a prospective cohort［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2013

9 Lee J，Suh C，Huh J，et al．Effect of positive bone marrow EBV in situ hybridization in staging and survival of localized extranodal natural killer/T － cell lymphoma，nasal－ type［J］．Clin Cancer Res，2007，13(11):3250－3254

10 彭金昀，唐運(yùn)蓮，何潔．不同部位和類(lèi)型惡性淋巴瘤與EBV感染相關(guān)性研究［J］．中國(guó)腫瘤臨床，2008，35(20):1145－1149

11 Khan G．Screening for Epstein－Barr virus in Hodgkin's lymphoma［J］．MethodsMol Biol，2009，511:311 －322

12 Ashraf MJ，Makarempour A，Monabati A，et al．Comparison between presence of epstein barr virus in nodal and extra nodal diffuse large B cell lymphoma of head and neck，an Iranian experience［J］．Iran Red Crescent Med J，2012，14(12):764 －770