李 強，王世杰，胡小英，衛(wèi)陽飛，戚歡陽

(1、蘭州大學第一醫(yī)院心臟中心，甘肅蘭州730000;2.蘭州軍區(qū)機關門診部藥局，甘肅蘭州730000;3.中科院蘭州化學物理研究所，甘肅蘭州730000)

游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)是類脂代謝物的重要組成部分，測定FFA分子組成的改變、含量的變化和代謝轉(zhuǎn)換有助于揭示疾病中發(fā)生和發(fā)展的作用。目前很多研究揭示FFA能更準確敏感地反映機體脂代謝，是1個新的獨立預測冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危險因素。FFA水平與心肌損傷明顯相關，可作為冠心病心肌損傷的獨立預測指標，用于心肌損傷的監(jiān)測;FFA與無糖尿病的不穩(wěn)定心絞痛患者胰島素抵抗存在密切關系;而部分FFA可能對內(nèi)皮細胞和動脈粥樣硬化病變有保護作用[1-5]。同時FFA也和冠心病的等危癥——糖尿病的發(fā)病密切相關[6]。血液中FFA檢測可能有助于冠心病的早期診斷以及急性冠狀動脈綜合征不同類型的早期診斷、危險分層和預后評估。因此FFA已成為冠心病領域的研究熱點。

目前，生物樣品中FFA的衍生化氣相色譜法主要有烷化反應(酯化)、硅烷化反應、酰化反應等[7-8]。硅烷化作用是將FFA羧酸部分的活性氫被硅烷基取代，形成脂肪酸硅酯，三甲基硅烷衍生物熱穩(wěn)定性好，色譜性能好，便于氣相色譜分析。由于硅烷化反應必須在無水條件下進行，在一定程度上制約了其應用。因此硅烷化反應對生物樣品中FFA檢測的應用還相對較少。我們首次采用N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)對11種與疾病相關的常見FFA(壬酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十七烷酸、亞油酸、油酸、十八烷酸、花生四烯酸、花生五烯酸和二十烷酸)進行硅烷化反應，并利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)同時測定人血清凍干粉中11種FFA濃度，并將此方法應用于臨床實際血清樣品中FFA的分析檢測。

材料和方法

一、對象

實驗所用血清樣品取自2011年間蘭州大學第一醫(yī)院心臟中心住院的被確診為冠心病的患者。將新鮮采集到的血清樣品在－80℃下制成凍干粉備用。

二、儀器與試劑

1.儀器 Agilent 6890/5973N GC/MS，配有Agilent G 4513A自動進樣器和分流/不分離進樣口，Agilent DB-5MS毛細管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm)，Agilent色譜工作站和 NIST2008 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);CS201-1C型電熱鼓風干燥箱(重慶四達實驗儀器廠);BP221S型電子天平[Mettler-Toledo Instr.(ShangHai)Ltd];TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

2.試劑 BSTFA(上海晶純試劑有限公司，批號7807);N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA，Aladdin Chemistry Co.Ltd，批號 19478);無水甲醇、氯仿[分析純，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學有限公司];FFA標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司和Sigma公司)。

三、方法

1.標準品溶液的配制 精確稱取各標準品5.0 mg，用甲醇定容為1 mg/mL的混合標準品儲備液。

2.樣品制備方法 取3.0 mg血清凍干粉，加入300μL甲醇和100μL氯仿，超聲10 min后1 500×g離心10 min，取上清液，氮氣吹干后，加入30μL BSTFA 于70 ℃反應1 h，取1μL 反應液直接進樣。

3.色譜及質(zhì)譜條件 進樣口溫度270℃;升溫程序:80℃開始，以10℃/min升至245℃，以4℃/min升至280℃，溶劑延遲3 min;不分流進樣;高純氦氣(99.999%)流速 1.0 mL/min。離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃。

四、統(tǒng)計學方法

采用Agilent色譜工作站和NIST2008質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行色譜數(shù)據(jù)的獲取和處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用Excel和SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

結(jié) 果

一、血清預處理方法研究

通過蛋白沉淀劑比例和用量的選擇實驗，最終確定了4倍(重量體積比)的甲醇∶氯仿(v/v=3∶1)作為血清凍干粉最佳預處理試劑。見圖1。

圖1 蛋白沉淀劑選擇

二、衍生化方法研究

通過硅烷化試劑的選擇，衍生化反應溫度、時間的選擇以及衍生化試劑用量的選擇實驗，最終確定30μL BSTFA、70℃反應1 h的衍生化條件。見圖2。

三、色譜圖

標準品和加標血清中的11種FFA的色譜峰完全分離，峰形良好，血清中的雜質(zhì)對于目標分析物無影響。

圖2 衍生化反應條件優(yōu)化

圖3 標準和加標血清樣品色譜圖

四、標準曲線、檢測限(LODs)和定量限(LOQs)

取不同濃度梯度的混合FFA標準工作液30μL，干燥后加入30μL BSTFA 于 70 ℃ 反應1 h。以峰面積(X)對標準品濃度(Y)進行線性回歸分析，見表1。

五、精密度試驗

取0.1 mg/mL混合FFA標準工作液30μL，干燥后加入30μL BSTFA于70℃反應1 h，反應后 0、2、4、6、8、24、48 h 分別進樣計算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見表2。

六、重復性試驗

取0.1 mg/mL混合FFA標準工作液30μL，加入到3.0 mg血清凍干粉中，再加入300μL甲醇和100μL氯仿，超聲10 min后1 500×g離心10 min，取上清液，氮氣吹干后加入30μL BSTFA于70℃反應1 h，重復5次計算相對標準偏差(RSD)。結(jié)果見表2。

七、回收率試驗

分別取1.0、0.5、0.1 mg/mL 混合脂肪酸標準品30μL，加入到3.0 mg 血清凍干粉中，再加入300μL甲醇和100μL氯仿，超聲10 min后1 500×g離心10 min，取上清液，氮氣吹干后加入30μL BSTFA于70℃反應1 h，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 精密度、重復性和加樣回收率

八、臨床應用

精確稱取冠心病患者血清凍干粉3.0 mg，加入300μL 甲醇和 100μL 氯仿，超聲 10 min 后1 500×g離心10 min，上清液經(jīng)氮氣吹干后加入30μL BSTFA，70 ℃反應1 h，直接進樣分析。結(jié)果見表3。

表3 冠心病患者血清中FFA含量測定結(jié)果

討 論

血清樣品基質(zhì)復雜，直接測定對其中的FFA干擾很大。本研究將血清低溫制成凍干粉，一方面增強了血清樣品儲存過程中的穩(wěn)定性，另一方面有助于祛除樣品中的蛋白質(zhì)，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的FFA得以釋放。以甲醇、氯仿混合溶劑作為變性劑，能使蛋白成為絨毛狀沉淀，離心后得到的上清液很澄清，且沉淀不容易挾走待測物，使得樣品中的FFA提取完全。硅烷化作用是將FFA羧酸部分的活性氫被硅烷基取代，形成脂肪酸硅酯。由于硅烷化反應必須在無水條件下進行，在一定程度上制約該方法的應用。本研究將血清制成凍干粉，簡化了實驗過程并提高了反應效率。由于MSTFA反應產(chǎn)物對花生四烯酸和花生五烯酸的分離有干擾，而BSTFA的產(chǎn)物峰形相對較好，分離效果好，更利于氣相色譜分析。本研究確定的色譜條件對于11種與疾病相關的常見FFA都能實現(xiàn)較好的基線分離，且峰形良好，血清中雜質(zhì)對測定不產(chǎn)生干擾。在所測試的濃度范圍內(nèi)各FFA的線性關系良好，11種FFA的回收率均＞75%，日內(nèi)、日間精密度和重復性實驗的相對標準偏差(RSD)均＜10%。本研究通過選擇合適的人血清樣品前處理方法并優(yōu)化衍生化反應條件，建立了同時測定冠心病患者血清中11種FFA含量的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，該方法具有操作簡單、靈敏度高、準確性好、線性范圍寬等優(yōu)點，為冠心病患者血清FFA檢測提供了實驗基礎和依據(jù)。

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