張宗新，高 敏，汪 艷，陳葉龍

(湖州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江湖州313000)

特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)為一組自身免疫性疾病，系由于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，抗血小板抗體(platelet associated antibody，PAIg)產(chǎn)生，血小板數(shù)量破壞增加而出血的疾病。血液及骨髓中均存在血小板[1]，該類(lèi)患者由于機(jī)體中存在 PAIg[2]。目前一般只檢測(cè)血液中的血小板表面PAIg，極少見(jiàn)檢測(cè)骨髓標(biāo)本。然而部分ITP患者血液中血小板表面PAIg檢測(cè)，結(jié)果為陰性，為診斷帶來(lái)困難。為此，故我們檢測(cè)了ITP患者骨髓中血小板表面PAIg，探討對(duì)其ITP的臨床價(jià)值。

材料和方法

一、對(duì)象

選取湖州市中心醫(yī)院2012年7月至2013年6月血液科初次就診未治療的ITP患者50例，其中男19例，女31例，年齡22～66歲?；颊呔丛\斷標(biāo)準(zhǔn)[3](均符合以下條件:多次實(shí)驗(yàn)室檢查血小板計(jì)數(shù)減少;脾臟不增大或僅輕度增大;骨髓檢查巨核細(xì)胞數(shù)量增多或正常，有成熟障礙;潑尼松治療有效;排除繼發(fā)性血小板減少癥)確診為ITP。20例對(duì)照者為湖州市中心醫(yī)院內(nèi)科住院發(fā)熱待查的患者，經(jīng)骨髓穿刺涂片檢查(排除血液病)屬正常骨髓象，均無(wú)出血性疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，其中男9例，女11例，年齡19～59歲。

二、儀器與抗體

FACS Calibur流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD公司提供。Gt F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC、Gt F(ab')2 Anti-Human IgM-FITC、Gt F(ab')2 Anti-Human IgA-FITC、CD41-PE及同型對(duì)照 Goat F(ab')2 IgG-FITC均由美國(guó)Beckman-Coulter公司提供。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.標(biāo)本采集 所有對(duì)象在行骨髓穿刺涂片時(shí)抽取骨髓液 1.5 mL，用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝處理，同時(shí)采集外周血1.0 mL。

2.血小板的富集 將抗凝的新鮮骨髓液1.5 mL及抗凝血1.0 mL 400×g離心15 min，分離富血小板血漿(RPR)，取 RPR 50～200μL(根據(jù)血小板多少取適量，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)細(xì)胞數(shù)/mL)各置于塑料管A中，各加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)1 400×g離心15 min，去上清液后，加400μL鞘液定容。在塑料管 A中加入40μL CD41-PE，充分混勻。另取4支試管，分別加入上述4種單抗試劑10μL，再在各試管中加入塑料管A中的血小板懸液100μL，室溫暗處放置孵育15 min。再加入PBS 2 mL，1 400×g離心5 min洗滌1次，去上清后加1.0 mL鞘液定容。

3.流式分析 根據(jù)CD41/SSC設(shè)置血小板門(mén)，以同型對(duì)照管調(diào)整電壓及熒光補(bǔ)償，然后分別檢測(cè)骨髓液及血液標(biāo)本PAIgG、PAIgM、PAIgA熒光百分率和平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、對(duì)照組、ITP組骨髓、血液標(biāo)本血小板相關(guān)抗體結(jié)果比較

ITP組骨髓及血液PAIgG水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，PAIgM及PAIgA水平2種標(biāo)本間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與ITP患者骨髓、血液標(biāo)本血小板相關(guān)抗體結(jié)果比較 (%)

二、ITP患者2種標(biāo)本血小板相關(guān)抗體陽(yáng)性率比較

ITP患者骨髓標(biāo)本 PAIgG、PAIgM、PAIgA陽(yáng)性率分別為98%、42%、46%，總陽(yáng)性率為100%;均高于血液標(biāo)本(76%、38%、44%，總陽(yáng)性率為82%)。顯示骨髓標(biāo)本血小板相關(guān)抗體的敏感性更高。

表2 ITP患者2種標(biāo)本血小板相關(guān)抗體陽(yáng)性率比較

討 論

目前ITP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，患者血小板相關(guān)抗體的增高與血小板數(shù)及血小板壽命呈負(fù)相關(guān)[4]。PAIg是診斷ITP的1項(xiàng)敏感指標(biāo)。本研究顯示血液有82%的ITP患者血小板相關(guān)抗體陽(yáng)性，骨髓為100%陽(yáng)性。本研究血液數(shù)據(jù)略低于文獻(xiàn)報(bào)道[5]，而骨髓陽(yáng)性率明顯高于血液標(biāo)本。

本研究中骨髓PAIgG的濃度及陽(yáng)性率均明顯高于血液標(biāo)本相關(guān)指標(biāo)，可能是由于骨髓淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的血小板特異的IgG自身抗體[6]一方面優(yōu)先與血小板結(jié)合，同時(shí)骨髓內(nèi)結(jié)合了血小板抗體的血小板未被破壞，所以骨髓PAIgG水平及陽(yáng)性率升高。從骨髓釋放入血液的結(jié)合有血小板相關(guān)抗體的血小板在循環(huán)中進(jìn)入脾臟或其它單核巨噬系統(tǒng)后被識(shí)別破壞，導(dǎo)致血液中PAIgG水平降低。PAIgM為5價(jià)的多聚體，是機(jī)體受抗原刺激后最早產(chǎn)生的抗體。PAIgM可激活補(bǔ)體，較IgG類(lèi)高1 000倍左右，是具有最強(qiáng)活力的凝集抗體，其與血小板結(jié)合直接破壞大量血小板。PAIgA可以結(jié)合抗原，但不能激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑。因此，不能像PAIgG那樣發(fā)揮生物效應(yīng)。骨髓PAIgM、PAIgA水平及陽(yáng)性率與血液相當(dāng)或偏高也驗(yàn)證了此理論。

綜上所述，檢測(cè)骨髓PAIg可以提高ITP患者的輔助診斷率，具有一定的臨床價(jià)值。

[1]許文榮，王建中.臨床血液學(xué)檢驗(yàn)[M].第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:39-117.

[2]張之南，郝玉書(shū)，趙永強(qiáng)，等.血液病學(xué)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:1273-1274.

[3]張之南，沈 悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京:科學(xué)出版社，2007:172-176.

[4]李美玲，楊林花.血小板抗體及其檢測(cè)在特發(fā)性血小板減少性紫癜中的研究進(jìn)展[J].山西醫(yī)藥雜志，2007，36(4):325-327.

[5]李 明，臺(tái) 虹，歐陽(yáng)紅梅，等.PAIgG、PAIgA 和PAIgM在特發(fā)性血小板減少性紫癜診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2002，3(1):52-54.

[6]Nakhoul IN，Kozuch P，Varma M.Management of adult idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Clin Adv Hematol Oncol，2006，4(2):136-144.