王也飛，周 怡，丁 磊，夏文權(quán)，胡翊群

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)系，上海200025)

有核紅細(xì)胞(nucleated red blood cell，NRBC)即幼稚紅細(xì)胞。健康成年人外周血中無(wú)NRBC，但在胎兒外周血、新生兒或幼兒血液中可少量出現(xiàn)。成年人外周血中出現(xiàn)NRBC時(shí)，多為病理狀態(tài)，常見(jiàn)于一些溶血性貧血、急性大量失血、嚴(yán)重的組織缺氧、急慢性白血病、惡性腫瘤、骨髓纖維化癥等多種疾病。血液中的NRBC多為晚幼紅細(xì)胞，也可見(jiàn)中幼紅細(xì)胞或更幼稚的紅細(xì)胞(如紅血病、紅白血病)[1]。目前，多種血液分析儀已能對(duì)NRBC出現(xiàn)的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行提示和計(jì)數(shù)。國(guó)際實(shí)驗(yàn)血液學(xué)專(zhuān)家委員會(huì)及國(guó)內(nèi)專(zhuān)家提出，對(duì)于出現(xiàn)NRBC的血液標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)行顯微鏡鏡檢，以避免NRBC干擾白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果[2-3]。我們采用SYSMEX XN-1000全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀(簡(jiǎn)稱(chēng)XN-1000)對(duì)外周血標(biāo)本進(jìn)行NRBC的檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的顯微鏡形態(tài)學(xué)鏡檢方法(簡(jiǎn)稱(chēng)鏡檢法)及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)XN-1000在NRBC檢測(cè)方面的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

材料和方法

一、標(biāo)本來(lái)源

選取上海瑞金醫(yī)院溶血性貧血確診患者以及瑞金醫(yī)院門(mén)診檢驗(yàn)科Beckamn Coulter LH750全自動(dòng)血液分析儀提示檢測(cè)出NRBC患者的血液標(biāo)本共66例[真空采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝靜脈血2 mL]。

二、儀器與試劑

XN-1000及其配套試劑由日本Sysmex公司提供;BD FACS CANTO-II流式細(xì)胞儀及其配套熒光抗體標(biāo)記試劑[CD45 FITC(BD 555482)，PI(Sigma Chemical Co.PN#P-4170)]由美國(guó)BD公司和Sigma公司提供，;EDTA-K2真空采血管(紫蓋);OLYMPUS光學(xué)顯微鏡;瑞氏染液等。

三、NRBC計(jì)數(shù)方法

1.XN-1000檢測(cè) NRBC XN-1000有 WNR通道(即WBC/BASO和NRBC通道)，針對(duì)白細(xì)胞數(shù)檢測(cè)增加了NRBC的修正功能。在該通道中進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類(lèi)、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和NRBC計(jì)數(shù)。所用試劑之一的Lysercell WNR，其中的表面活性劑使紅細(xì)胞溶血的同時(shí)，透過(guò)白細(xì)胞的細(xì)胞膜。白細(xì)胞的外形和內(nèi)部構(gòu)造因各自的細(xì)胞特性而異。利用散射光(FSC、SSC)可捕捉其形態(tài)的差異，憑此將嗜堿性粒細(xì)胞和其它的白細(xì)胞區(qū)別;另一試劑Fluorocell WNR，對(duì)白細(xì)胞及NRBC的核酸和細(xì)胞器進(jìn)行熒光染色。在Lysercell WNR試劑中白細(xì)胞比NRBC的染色部位多，在Fluorocell WNR試劑中其熒光強(qiáng)度也比NRBC強(qiáng)。根據(jù)熒光量的差異，將NRBC和其他的白細(xì)胞區(qū)別和計(jì)數(shù)(見(jiàn)圖1，由Sysmex公司提供)，得到NRBC絕對(duì)數(shù)(×109/L)及NRBC百分率(NRBC%)，記錄上述數(shù)據(jù)。

圖1 Sysmex XN-1000檢測(cè)NRBC

2.FCM檢測(cè)有核紅細(xì)胞[4-6]對(duì)待測(cè)抗凝全血標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)處理后予以CD45/PI染色。碘化丙啶(propidium iodide，PI)是一種常用的對(duì)DNA染色的細(xì)胞核熒光染色劑。PI不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能透過(guò)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的膜而將細(xì)胞核染紅。PI在540 nm綠色光激發(fā)下，在600 nm紅色光處發(fā)出明亮的熒光;CD45-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體設(shè)門(mén)圈出白細(xì)胞，NRBC具有CD45－/PI+的特點(diǎn)與白細(xì)胞CD45+/PI+及細(xì)胞碎片CD45－/PI－相區(qū)別(圖2)。

圖2 FCM檢測(cè)NRBC結(jié)果分析

3.鏡檢法 取5μL外周血，做厚薄均勻的血涂片并進(jìn)行瑞氏染色，然后在血膜體尾交界細(xì)胞分布均勻處用油鏡分類(lèi)400個(gè)白細(xì)胞，同時(shí)計(jì)數(shù)所見(jiàn)的 NRBC 數(shù)[7]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0和MedCalc統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、線(xiàn)性回歸分析及受試者工作特征(ROC)曲線(xiàn)分析。按照H26-A2建議，方法比較散點(diǎn)圖用Bland-Altman偏移散點(diǎn)圖，相關(guān)性統(tǒng)計(jì)采用 Passing-Bablok回歸法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、XN-1000與鏡檢法計(jì)數(shù)NRBC百分率的相關(guān)性

對(duì)XN-1000和鏡檢法每分類(lèi)100個(gè)白細(xì)胞所計(jì)數(shù)的NRBC百分率(NRBC%)結(jié)果采用Passing-Bablok回歸法進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示二者之間呈良好的線(xiàn)性相關(guān)。XN-1000測(cè)定值(Y)對(duì)鏡檢法測(cè)定值(X)的直線(xiàn)回歸方程為Y=－0.057 95+1.016 6X，r=0.927，P ＜ 0.05，見(jiàn)圖 3，兩者的Bland-Altman偏移散點(diǎn)圖見(jiàn)圖4。XN-1000與鏡檢法結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.205)。

二、FCM與鏡檢法計(jì)數(shù)NRBC%的相關(guān)性

對(duì)FCM和鏡檢法所計(jì)數(shù)的NRBC%采用Passing-Bablok回歸法進(jìn)行相關(guān)性分析。FCM測(cè)定值(Y)對(duì)鏡檢法測(cè)定值(X)的直線(xiàn)回歸方程為Y=0.050 0+1.321 8X，r=0.956，P ＜0.05。FCM與鏡檢結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.563)。

圖3 XN-1000與鏡檢法計(jì)數(shù)NRBC%的相關(guān)性

圖4 XN-1000與鏡檢法計(jì)數(shù)NRBC%的Bland-Altman偏移散點(diǎn)圖

三、XN-1000與FCM計(jì)數(shù)NRBC%的相關(guān)性

對(duì)XN-1000與FCM所計(jì)數(shù)的NRBC%采用Passing-Bablok回歸法進(jìn)行相關(guān)性分析。XN-1000測(cè)定值(Y)對(duì)FCM測(cè)定值(X)的直線(xiàn)回歸方程為Y= －0.116 9+0.779 3X，r=0.994，P ＜0.05。

2種方法與鏡檢法結(jié)果比較的ROC曲線(xiàn)見(jiàn)圖5。XN-1000診斷敏感度為60.0%，診斷特異性為 95.7%，曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.732，檢測(cè)的參考值臨界點(diǎn)為0.4;FCM診斷敏感度為70.0%，診斷特異性為89.7%，AUC 為0.838，檢測(cè)的參考值臨界點(diǎn)為0.8;以鏡檢法為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù) NRBC%，F(xiàn)CM和XN-1000 2種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.316)。

圖5 XN-1000、FCM與鏡檢法結(jié)果比較的ROC曲線(xiàn)

討 論

本研究比較了XN-1000、FCM及鏡檢法NRBC的檢測(cè)結(jié)果。由于大部分標(biāo)本選擇了異常細(xì)胞較為單一的溶血性貧血患者的EDTA-K2抗凝靜脈血，其中含其他異常細(xì)胞較少，因此在形態(tài)學(xué)方面干擾也較少，所得結(jié)果的可靠性應(yīng)較為理想。少部分標(biāo)本選自瑞金醫(yī)院門(mén)診檢驗(yàn)科BECKMANCOULTER LH750全自動(dòng)血液分析儀初篩為陽(yáng)性的患者。

對(duì)上述標(biāo)本總結(jié)發(fā)現(xiàn)，外周血中出現(xiàn)NRBC患者主要來(lái)自以下幾個(gè)典型科室:血液科47.4%，兒科10.3%、感染科 6.4%、腎臟科 5.1%、皮膚科3.8%。其原因可能是:正常情況下新生兒或幼兒血液中存在NRBC，而成人體內(nèi)出現(xiàn)NRBC多與溶血性貧血、急慢性白血病、感染等有關(guān)[8]。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，白血病、貧血者外周血易出現(xiàn)NRBC。當(dāng)臨床疑為血液病或已確診為血液病患者，復(fù)查血細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選擇NRBC計(jì)數(shù)，以免漏診[9]。有些標(biāo)本外周血中白細(xì)胞極度減低，這對(duì)血液分析儀、流式細(xì)胞儀及手工法的測(cè)定產(chǎn)生一定誤差。由本研究XN-1000和鏡檢法的計(jì)算方法可知，NRBC%得到需用WBC絕對(duì)計(jì)數(shù)值，上述原因也間接影響了NRBC%結(jié)果準(zhǔn)確性。

通過(guò)對(duì)測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析顯示，XN-1000在測(cè)定NRBC方面與鏡檢法結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，二者線(xiàn)性擬合情況也較好。以鏡檢法為金標(biāo)準(zhǔn)，XN-1000檢測(cè)NRBC的診斷敏感度為 60.0%，診斷特異性為 95.7%，AUC為0.732。從上述情況來(lái)看，XN-1000檢測(cè)NRBC有較高的診斷特異性。然而也有文獻(xiàn)對(duì)手工操作的“金標(biāo)準(zhǔn)”有質(zhì)疑。因其檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量少，人為主觀性較大，部分標(biāo)本客觀存在白細(xì)胞數(shù)目極度減低的客觀原因，有時(shí)作為對(duì)照的鏡檢法也無(wú)法完全得到十分準(zhǔn)確的結(jié)果 。多數(shù)文獻(xiàn)中，手工法NRBC%測(cè)定通過(guò)計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，同時(shí)計(jì)數(shù)所見(jiàn)的NRBC數(shù)來(lái)計(jì)算得到。本研究為了使結(jié)果更加準(zhǔn)確，基本上每張涂片在盡可能的情況下已計(jì)數(shù)到400個(gè)白細(xì)胞，但仍不能排除誤差的客觀存在。加之在血液分析儀、流式細(xì)胞儀操作時(shí)，儀器本身對(duì)細(xì)胞熒光標(biāo)記、檢測(cè)方面的精度差異，導(dǎo)致了上述現(xiàn)象存在。

目前，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定NRBC相關(guān)數(shù)據(jù)不作為臨床檢驗(yàn)的常規(guī)方法。本研究引入了FCM，旨在從另一個(gè)方面對(duì)XN-1000的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比對(duì);同時(shí)，鑒于鏡檢法因計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)遠(yuǎn)低于全自動(dòng)血液分析儀，故要比較這2種在方法學(xué)上完全不同而造成精密度差異較大的方法，可能不夠恰當(dāng)。因此，用FCM來(lái)替換鏡檢法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而能達(dá)到和全自動(dòng)血液分析儀相似的精密度[10]。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)CM與鏡檢法的測(cè)定結(jié)果差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，二者線(xiàn)性相關(guān)較好(r=0.956)，r值高于 XN-1000與鏡檢法的 r值(0.927)。FCM的診斷敏感性為70.0%，但特異性卻較 XN-1000差，為 89.7%，AUC為0.838，檢測(cè)參考值臨界點(diǎn)為 0.8。XN-1000與FCM的檢測(cè)結(jié)果具有極佳的相關(guān)性。從兩者的ROC曲線(xiàn)來(lái)看，其AUC均在0.7～0.9之間，表示測(cè)定具有一定的準(zhǔn)確性。其中FCM檢測(cè)結(jié)果具有更大的AUC，為0.838。若不考慮操作可行性、檢測(cè)成本等因素，F(xiàn)CM是比血液分析儀更好的方法。XN-1000的靈敏度(真陽(yáng)性率)為60.0%，低于 FCM，但特異性為 95.7%，高于FCM，其檢測(cè)參考值臨界點(diǎn)為0.4。這2種方法的臨界點(diǎn)均較靠近左上角，說(shuō)明假陽(yáng)性和假陰性的總數(shù)較少，準(zhǔn)確性較高。

外周血中出現(xiàn)NRBC是多種疾病過(guò)程中可出現(xiàn)的一種病理狀態(tài)，進(jìn)行NRBC檢測(cè)有較為廣泛臨床意義。XN-1000測(cè)定外周血NRBC的特異性和準(zhǔn)確性較高，方法簡(jiǎn)便，值得在臨床推廣。

[1]趙 燕，蔡朝陽(yáng)，王雪迎，等.XE-2100全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)有核紅細(xì)胞的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2010，12(3):221-224.

[2]Barnes PW，McFadden SL，Maehin SJ，et al.The international consensus group for hematology review:suggested criteria for action following automated CBC and WBC differential analysis[J].Lab Hematol，2005，11(2):83-90.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)全國(guó)血液學(xué)復(fù)檢專(zhuān)家小組，中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志編輯委員會(huì).全國(guó)血液學(xué)復(fù)檢專(zhuān)家小組工作會(huì)議紀(jì)要暨血細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)復(fù)檢標(biāo)準(zhǔn)釋義[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(4):380-382.

[4]Igout J，F(xiàn)retigny M，Vassee M，et al.Evaluation of the coulter LH 750 haematology analyzer compared with flow cytometry as the reference method for WBC，platelet and nucleated RBC count[J].Clin Lab Haematol，2004，26(1):1-7.

[5]Larghero J，Rea D，Brossard Y，et al.Prospective flow cytometric evaluation of nucleated red blood cells in cord blood units and relationship with nucleated and CD34(+)cell quantification[J].Transfusion，2006，46(3):403-406.

[6]Tsuji T，Sakata T，Hamaguchi Y，et al.New rapid flow cytometric method forthe enumeration of nucleated red blood cells[J].Cytometry，1999，37(4):291-301.

[7]Kim SJ，Kim YJ，Shin S，et al.Comparison study of the rates of manual peripheral blood smear review from 3 automated hematology analyzers，unicel DxH 800，ADVIA 2120i，and XE 2100，using international consensus group guidelines[J].Arch Pathol Lab Med，2012，136(11):1408-1413.

[8]慕悅意，李筱梅，李 勇，等.XE-5000血液分析儀檢測(cè)有核紅細(xì)胞的評(píng)價(jià)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(8):667-670.

[9]李建英.血細(xì)胞分析儀自動(dòng)計(jì)數(shù)外周血有核紅細(xì)胞的應(yīng)用研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(6):606-609.

[10]Fernandes BJ.Identification and enumeration of nucleated red blood cells in peripheral blood[J].Sysmex J International，2002，12(2):56-62.