姚如恩，傅啟華，余永國

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海200127;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心兒內(nèi)科，上海200127)

一直以來，臨床針對智力落后、多發(fā)畸形患者診斷的首選方法和金標(biāo)準(zhǔn)都是對培養(yǎng)的中期細(xì)胞核進(jìn)行傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)的染色體核型分析。隨著人們對細(xì)胞遺傳學(xué)研究的深入了解，染色體核型技術(shù)的分辨率和準(zhǔn)確性已經(jīng)不能完全滿足于臨床診斷要求。近年來全基因組芯片技術(shù)(chromo-somal microarray analysis，CMA)的發(fā)展和在臨床的初步應(yīng)用探索，展示了該技術(shù)平臺無可比擬的優(yōu)越性，全基因組芯片平臺已經(jīng)在產(chǎn)前和產(chǎn)后的診斷中展示出該平臺在特異性和敏感性上的優(yōu)勢[1]。我們利用基因分型(genotyping)全基因組芯片技術(shù)對9例染色體核型分析結(jié)果異常的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，試圖明確患者基因組失衡情況，驗(yàn)證兩種不同平臺的相符程度和準(zhǔn)確性，評價(jià)芯片平臺在針對智力落后、多發(fā)畸形等適應(yīng)癥的臨床適用性。

材料和方法

一、研究對象

納入本研究的樣本共9例，其中男4例，女5例，年齡6月～7歲，均為智力落后合并發(fā)育遲緩患者，部分患者同時(shí)有面部畸形的表現(xiàn)，如眼距寬、耳位低、通貫手和小頭畸形等。所有患者均來自上海兒童醫(yī)學(xué)中心遺傳科或兒童保健科。

二、染色體核型分析

靜脈采集受檢患者外周血3 mL，肝素抗凝，無菌條件下將約 0.3 mL抗凝血接種于RPMI-1640培養(yǎng)基，隔水式恒溫培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng) 70 h，加入秋水仙素工作液 0.05 mL(0.05 μg/mL)作用 50 min 后收獲細(xì)胞，經(jīng)低滲處理、固定作用后染色體標(biāo)本制備，G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。嵌合體計(jì)數(shù)100個(gè)中期分裂相。根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN，1995年)進(jìn)行識別和描述。

三、全基因組芯片分析技術(shù)

全基因組芯片試劑為Affymetrix CytoScan Assay Kit(Affymetrix，Santa Clara，CA)和 Clontech TITANIUMTMDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，Mountain View，CA);芯片操作儀器包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystem，F(xiàn)ostercity，CA)、雜交爐 Gene-Chip?Hybridization Oven 645，洗滌工作站Gene-Chip?Fluidics Station、掃描儀GeneChip?Scanner 3000 7G(Affymetrix，Santa Clara，CA)。具體的操作依照Affymetrix公司標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，包括樣本限制性酶內(nèi)切、引物結(jié)合片段連接、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物片段化處理、生物素?zé)晒鈽?biāo)記、雜交和洗滌等步驟。芯片結(jié)果分析軟件為AGCC(Affymetrix GeneChip Convert Console)和CHAS(Chromosome Analysis Suite Version 2.0.0)。

結(jié) 果

9例患者異常核型結(jié)果2例為Turner綜合征核型(均為嵌合型)45，X[94]/46，X，+mar[6]和45，x[54]/46，X，dic r(x)[46];2 例為染色體隨體增大46，XY，15ps+ 和 46，XX，13ps+;1 例為染色體內(nèi)倒位46，XX，inv(9)(p12，q13);1例為平衡易位46，xy，t(4:11)(q35:q21);3例為染色體微缺失或微插入46，xx，add(10)(q26)，46，xy，add(12)(p13)和 46，xy，del(13)(q14q22)。

利用全基因組芯片技術(shù)檢測該9例患者全基因組結(jié)構(gòu)性變化結(jié)果:2例Turner綜合征患者顯示X染色體均為雜合性缺失，拷貝數(shù)(CN state)分別為1.07和1.08(圖1);2例隨體增大患者和1例染色體內(nèi)倒位患者全基因組未見結(jié)構(gòu)性變化;1例平衡易位患者染色體上出現(xiàn)多段缺失(chr1，1p31.1-31.3;chr4，4q32.3;chr11.11q14.1-14.3)。

圖1 2例Turner綜合征患者X染色體拷貝數(shù)(CN state)和對照

3例微缺失或插入患者檢測結(jié)果為:8號染色體插入合并10號染色體缺失(chr8:99804212-146295771 Gain 46.5mb 8q22.2-qter chr10:127441438-135427143 Loss 7.99mb 10q26.2-qter)，12 號染色體插入 (chr12:29766862-50507802 Gain 20.7mb 12p11.22-q13.12 chr19:28271146-28829404 Gain 558kb 19q11-q12);13號染色體缺失(chr13:63187793-93266080 Loss 30mb 13q21.3-q31.3)(圖2)。

圖2 3例患者染色體插入或缺失染色體核型結(jié)果和芯片分析結(jié)果對比

討 論

染色體核型技術(shù)一直以來是臨床診斷先天性智力落后合并發(fā)育遲緩、以及多發(fā)畸形等相關(guān)適應(yīng)癥的首選方法，但是該方法的準(zhǔn)確性和敏感度已無法完全滿足臨床診斷的需要。特別是基因芯片技術(shù)在平臺發(fā)展和成本控制兩方面做得越來越好的情況下，國外已經(jīng)有大量臨床診斷實(shí)驗(yàn)室將基因芯片替代染色體核型診斷技術(shù)，作為相關(guān)適應(yīng)癥的首選診斷方式。

本研究中的9例患者均以相同或相近的表型在本院遺傳科或兒保科就診，在染色體核型結(jié)果僅能提供比較模糊的診斷信息的情況下，我們采用基因分型全基因組芯片對這9例患者再次進(jìn)行檢測，通過全基因組芯片技術(shù)的檢測結(jié)果，試圖來驗(yàn)證染色體核型的結(jié)果，明確患者的遺傳背景，幫助臨床做出準(zhǔn)確診斷。

9例患者中2種技術(shù)平臺結(jié)果相符的只有2例，為Turner綜合癥患者，2例患者均為嵌合型X染色體缺失。值得注意的是，在嵌合程度的解釋上，核型分析是通過計(jì)數(shù)不同核型的細(xì)胞，而全基因組芯片是通過相應(yīng)染色體區(qū)域內(nèi)探針拷貝數(shù)值的大小平均值進(jìn)行預(yù)測。在大多數(shù)情況下，Turner綜合征的患者可存在多種細(xì)胞核型嵌合的情況[2]，導(dǎo)致全基因組芯片在整條X染色體上的拷貝數(shù)值出現(xiàn)波動，無法準(zhǔn)確估算出嵌合率。因此，當(dāng)Turner綜合征患者存在多種核型細(xì)胞嵌合的時(shí)候，染色體核型分析技術(shù)，更加有利于明晰患者的遺傳背景，做出準(zhǔn)確的臨床診斷。

2例染色體核型分別報(bào)告為13號和15號隨體增加的患者，全基因芯片分析結(jié)果為陰性，即全基因組未見明顯的失衡現(xiàn)象。隨體是識別染色體的主要特征之一，隨體增加在人群中有多態(tài)性的存在，并不能直接作為患者致病的遺傳背景作為臨床診斷和解釋臨床癥狀。雖然有相關(guān)研究證明隨體增大和耳聾或不良孕產(chǎn)史相關(guān)，但將隨體增大作為對于臨床智力落后，發(fā)育遲緩患者的診斷顯然是不恰當(dāng)?shù)?。?例染色體內(nèi)倒位的患者，全基因組分析結(jié)果也為陰性，提示在染色體斷裂位點(diǎn)沒有發(fā)生缺失，但斷裂位點(diǎn)是否涉及具體的基因的情況，沒有辦法通過這2種技術(shù)平臺檢測到。最近發(fā)展起來的通過配對文庫(mate-pair library)二代測序技術(shù)，可以同時(shí)檢測到染色體平衡性和非平衡性的結(jié)構(gòu)性變化[3]。

另外4例患者染色體核型分析結(jié)果為微插入和微缺失，全基因組芯片分析結(jié)果與核型分析結(jié)果相差較大。其中1例患者染色體核型分析結(jié)果為10號染色體上有段缺失，但全基因組芯片結(jié)果為10號染色體插入，同時(shí)檢測到染色體核型未檢出的8號染色體上的大片段缺失;另2例患者全基因組芯片分析檢測的微插入片段的大小和具體的染色體區(qū)帶位置也與染色體核型分析結(jié)果存在較大偏差(圖2)，這可能是由于常用的G顯帶染色方法中秋水仙素處理的時(shí)間及濃度、低滲等對染色體顯帶的效果產(chǎn)生較大的影響，導(dǎo)致每次處理的效果都不相同[4];1例平衡易位的患者，經(jīng)全基因芯片技術(shù)分析為復(fù)雜性染色體核型重排(complex chromosomal rearrangement)，根據(jù)相關(guān)研究證實(shí)復(fù)雜性染色體重排會導(dǎo)致先天性的智力落后發(fā)育遲緩以及多發(fā)畸形[5]，因此全基因組芯片檢測結(jié)果更具有臨床診斷意義。

通過9例患者染色體核型分析結(jié)果與全基因組芯片分析結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)核型技術(shù)在診斷相關(guān)適應(yīng)癥的實(shí)際應(yīng)用中存在準(zhǔn)確性和敏感性不足的問題，而利用全基因組芯片分析技術(shù)，能對染色體非平衡性變化進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測和定位，對患者遺傳背景的解釋較為可靠，對臨床診斷的幫助較大;但對平衡性染色體結(jié)構(gòu)變化如倒位等，全基因組芯片無法檢測到斷裂點(diǎn)和涉及的基因。因此建議臨床在診斷相關(guān)適應(yīng)癥時(shí)，可將染色體芯片技術(shù)作為首選技術(shù)，用于提高診斷效率，需要檢測患者染色體平衡性變化時(shí)仍可采用染色體核型技術(shù)。

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