張 軍，王曉飛，王瑞東，韓 敏，景玲杰，陳 晉

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200433)

肺結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴痰涂片和培養(yǎng)，由于涂片的陽(yáng)性率低，培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)，這些應(yīng)用都無(wú)能完全滿足臨床診斷的需求。近年來，分子診斷最為一種快速診斷的手段，在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室得到廣泛的開展，其中熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA是1種常見的手段，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上有達(dá)安基因、凱杰生物、科華生物等多家廠家提供熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。國(guó)外市場(chǎng)上類似的產(chǎn)品有羅氏公司的Amplicor Cobas?MTB 檢測(cè)系統(tǒng)[1]，BD 公司的 BD Probe-TecTMET MTB System[2]和 Cepheid 公司 Gene Xpert?MTB/RIF[3]等產(chǎn)品。文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)熒光定量PCR在確診結(jié)核患者的陽(yáng)性檢出率在55.28%左右[4]，而國(guó)外公司的產(chǎn)品的陽(yáng)性檢出率在80% ～100%范圍內(nèi)[3]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)的產(chǎn)品。除了產(chǎn)品設(shè)計(jì)的原因之外，如何有效的進(jìn)行結(jié)核桿菌DNA的提取是影響最終檢出率的重要因素。對(duì)此，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室都有了一些有益的探索[5]。

我們實(shí)驗(yàn)室常規(guī)采用凱杰生物公司的結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行痰液的結(jié)核菌DNA定量檢測(cè)。為了提高結(jié)核桿菌的臨床檢出率，我們主要采用了增加痰液量和超聲破碎的方法來提高痰液標(biāo)本的結(jié)核菌陽(yáng)性檢出率。在幾乎沒有增加實(shí)驗(yàn)成本的情況下，取得了非常好的效果。

材料和方法

一、患者的選取

選取上海市肺科醫(yī)院2012年3月～2013年2月的疑似結(jié)核病初診患者，疑似患者主要根據(jù)臨床癥狀、體征及胸部X線或者CT表現(xiàn)。所有患者進(jìn)行痰涂片、培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核菌。最終有206例臨床確診為肺結(jié)核病例作為我們的研究對(duì)象，其確診標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以下3個(gè)條件:(1)有臨床癥狀、體征和X線或者CT表現(xiàn);(2)痰培養(yǎng)陽(yáng)性并鑒定為結(jié)核分枝桿菌;(3)臨床抗結(jié)核治療有效。另有103例確診為非結(jié)核患者，主要為細(xì)菌性肺炎、支氣管擴(kuò)張癥以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。

二、試劑和儀器

4%NaOH本實(shí)驗(yàn)室自行配制。染色液:金胺“0”1 g溶于95% 乙醇100 mL中，加5% 石炭酸液900 mL混勻即可。脫色劑:3%鹽酸酒精。復(fù)染劑:高錳酸鉀0.5 g，溶于100 mL蒸餾水。結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR試劑盒由凱杰生物公司提供。儀器為ROCHE LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche公司)。MGIT 960結(jié)核菌液體快速培養(yǎng)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)。

三、痰標(biāo)本的收集

收集痰標(biāo)本之前，患者需刷牙、漱口，并深咳后留痰?；颊叱Ｒ?guī)留取3次痰涂片。痰培養(yǎng)的痰液量為2～5 mL。熒光定量PCR留取的痰液量為5～10 mL(留取時(shí)間為24 h之內(nèi)，累積收集)，采用50 mL的尖底無(wú)菌離心管收集痰標(biāo)本。

四、痰涂片檢測(cè)

每個(gè)標(biāo)本同時(shí)按標(biāo)準(zhǔn)(2 cm×1 cm)涂2張大小、厚度相當(dāng)?shù)钠哟?，火焰固定，染色、熒光顯微鏡下鏡檢。染色方法:將痰液涂片用熒光染色液染10 min，水洗后用3% 的鹽酸酒精脫色1～2 min，至外觀無(wú)黃色為止，水洗后加復(fù)染劑1～2 min，水洗，晾干。

五、痰培養(yǎng)檢測(cè)

痰液以2～3倍體積4%NaOH液化15 min后，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入 45 mL生理鹽水，震蕩混勻后，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;同樣方法，再次洗滌1遍。最后加入1 mL生理鹽水，重懸沉淀，取0.5 mL用于(美國(guó)BD公司MGIT 960)液體快速培養(yǎng)。所有培養(yǎng)陽(yáng)性均經(jīng)過菌種鑒定，確認(rèn)為人結(jié)核分枝桿菌。

六、熒光定量PCR檢測(cè)步驟

1.痰標(biāo)本消化處理 根據(jù)痰液黏稠度加入2～3倍體積的4%NaOH，充分震蕩混勻后，室溫放置15～20 min，待痰液充分液化后，混勻，吸取1.0 mL至1.5 mL的離心管中，用于按照試劑盒說明書進(jìn)行的DNA抽提。剩余的痰標(biāo)本用于改進(jìn)的超聲破碎DNA抽提步驟。

2.試劑盒的DNA抽提步驟(常規(guī)法) 液化好的痰液置于4℃低溫離心機(jī)中，5 000×g，離心5 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入1 mL生理鹽水，震蕩混勻后，5 000×g，離心5 min，小心棄上清，留取底部沉淀;再加入1 mL生理鹽水，5 000×g，離心5 min，棄上清;加入試劑盒提供的40μL DNA抽提液，充分震蕩混勻;100℃干浴10 min;12 000×g離心10 min后，取上清2μL用于熒光定量PCR檢測(cè)。

3.改進(jìn)超聲破碎法DNA抽提步驟(增量超聲法) 液化好的痰液置于4℃低溫離心機(jī)中，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入45 mL生理鹽水，震蕩混勻后，3 000×g，離心15 min，小心棄上清，留取底部沉淀;加入1 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中，5 000×g，離心5 min，棄上清;加入試劑盒提供的40μL DNA抽提液，充分震蕩混勻;100℃干浴10 min;待標(biāo)本降至室溫后，放入水浴超聲破碎儀中，300 W功率，超聲破碎15 min。12 000×g離心10 min后和常規(guī)提取的DNA標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分別統(tǒng)計(jì)2種不同的處理方法對(duì)于結(jié)核診斷的敏感性、特異性。采用卡方檢驗(yàn)比較2組方法的差異性。將定量結(jié)果轉(zhuǎn)換為以2為底的對(duì)數(shù)值，采用配對(duì)T檢驗(yàn)比較2種方法定量結(jié)果之間的差異，并用線性回歸方法對(duì)兩者之間的結(jié)果進(jìn)行回歸和相關(guān)分析。所有統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行計(jì)算處理。

結(jié) 果

一、增量超聲法顯著提高了結(jié)核患者的陽(yáng)性檢出率

所有結(jié)核患者痰培養(yǎng)均陽(yáng)性，對(duì)照組痰培養(yǎng)均為陰性。兩種不同的標(biāo)本處理方法檢測(cè)結(jié)核和非結(jié)核患者的結(jié)果見表1。采用增量超聲法，對(duì)于涂片陽(yáng)性、培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核患者，陽(yáng)性檢出率(敏感性)由 87.5%(可信區(qū)間為 81.4% ～93.6%)提升至 95.5%(可信區(qū)間為 91.7% ～99.4%)(P ＜0.05)。對(duì)于涂片陰性、培養(yǎng)陽(yáng)性的患者，陽(yáng)性檢出率由57.4%(可信區(qū)間為47.5%～67.4%)提高至 83%(可信區(qū)間為75.4% ～90.6%)(P ＜0.01)。2 種方法的特異性均為97.1%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表1 2種不同的標(biāo)本處理方法檢測(cè)痰液中結(jié)核菌DNA的定性結(jié)果

二、增量超聲法的定量結(jié)果較常規(guī)方法有顯著的提高

采用配對(duì)T檢驗(yàn)比較兩者之間定量結(jié)果的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增量超聲法的定量結(jié)果明顯高于常規(guī)方法(P=0.000)，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.900。采用線性回歸擬合兩者的相關(guān)方程為:log2(增量超聲法)=1.071×log2(常規(guī)法)+3.786。也就是說增量超聲法比常規(guī)方法，定量值平均提高14倍以上。圖1為兩者的線性回歸分布圖。

圖1 增量超聲法和常規(guī)法定量結(jié)果回歸分析圖

討 論

目前我國(guó)結(jié)核病的診斷的實(shí)驗(yàn)室檢查還是依賴于傳統(tǒng)的細(xì)菌涂片和培養(yǎng)。2000年以來，在一些有條件的醫(yī)院逐漸開展結(jié)核菌的快速培養(yǎng)和基因檢測(cè)[6-8]。一般來說抗酸染色涂片檢測(cè)結(jié)核菌的敏感性在104～105 cfu/mL，濃縮涂片的敏感性可以達(dá)到102 cfu/mL[9]。液體培養(yǎng)的敏感性在10～100 cfu/mL。分子生物學(xué)的檢測(cè)敏感性可以達(dá)到10 cfu/mL[10]，也就是說分子診斷的靈敏度和液體培養(yǎng)接近。由于分子診斷具有較高的敏感性和特異性，因此，出現(xiàn)了各種各樣的結(jié)核基因診斷檢測(cè)方法，如熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核DNA、等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)核RNA等。本研究采用國(guó)產(chǎn)的熒光定量PCR試劑，采用常規(guī)方法，對(duì)肺結(jié)核的診斷敏感性為73.8%，這個(gè)結(jié)果和國(guó)內(nèi)一些結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的研究報(bào)道類似[4]。采用改進(jìn)的增量超聲破碎法處理標(biāo)本后，對(duì)于肺結(jié)核的診斷敏感性提高到了89.8%，基本接近于國(guó)際先進(jìn)的Gene Xpert?MTB/RIF 等產(chǎn)品報(bào)道的結(jié)果[1，3]。當(dāng)然，這需要進(jìn)一步的對(duì)比研究才能得出確切的數(shù)據(jù)。本研究結(jié)果表明，增量超聲法CT值較常規(guī)方法平均減少3.786，也就是相當(dāng)于增加14倍的DNA濃度。因此，改進(jìn)的標(biāo)本處理方法顯著的提高了診斷的敏感性和定量數(shù)值。

分子診斷雖然具有較高的敏感性，但是由于是手工操作，存在交叉污染的可能性，因此其特異性也是一個(gè)非常值得關(guān)注的問題，本研究結(jié)果表明增量超聲破碎法并沒有因?yàn)樵黾恿颂狄毫亢统暺扑榈牟襟E，而導(dǎo)致診斷的特異性下降。

在本研究中，常規(guī)方法使用的痰液量?jī)H為0.3～0.5 mL左右，而增量超聲法的痰液量在5～10 mL，相當(dāng)于前者的10～300倍;也就是相當(dāng)于有10～300倍的結(jié)核菌被用于核酸抽提，充足的結(jié)核菌是提高肺結(jié)核診斷敏感性的主要原因。另外，常規(guī)方法主要采用裂解液和煮沸來破壞結(jié)核菌菌體，達(dá)到釋放結(jié)核菌DNA的效果。而本研究除了采用裂解液裂解和煮沸之外，還增加了國(guó)際上公認(rèn)的最有效的超聲破碎法來進(jìn)一步提高菌體裂解效果。在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)痰液在采用氫氧化鈉液化后，經(jīng)常會(huì)有一些較大、硬的沉淀物殘留。為了保證充分的裂解效果，本研究采用了大功率(300 W)超聲破碎儀，并作用較長(zhǎng)的時(shí)間(15 min)。大功率、長(zhǎng)時(shí)間的超聲破碎能夠充分的釋放菌體中的DNA，因而也是診斷敏感性和定量結(jié)果提高的另一個(gè)重要原因。

國(guó)際上有很多提高結(jié)核分子診斷敏感性的手段，如采用超聲破碎提取結(jié)核菌，采用磁珠純化結(jié)核菌DNA，以及采用巢氏PCR來提高PCR檢測(cè)的靈敏度。采用磁珠純化等方法純化DNA是一條必然要走的道路，因?yàn)樘狄褐苯恿呀馕镏袝?huì)存在一些雜質(zhì)，抑制 PCR的反應(yīng)[5]。國(guó)際先進(jìn)的Gene Xpert?MTB/RIF產(chǎn)品就是采用磁珠純化DNA方法來抽提痰液中結(jié)核菌的DNA，在手工操作時(shí)由于增加了DNA純化的步驟，無(wú)疑增加了試劑成本和檢測(cè)產(chǎn)物交叉污染的可能性。巢氏PCR雖然能提高診斷的敏感性，但是采用手工操作時(shí)，交叉污染的危險(xiǎn)大增，可能會(huì)導(dǎo)致較高的假陽(yáng)性。因此，我們認(rèn)為其只適合于自動(dòng)化的儀器操作檢測(cè)系統(tǒng)，如 Gene Xpert?MTB/RIF產(chǎn)品。本研究結(jié)果表明，通過增加痰液量和超聲破碎提取核酸法，可以明顯的提高結(jié)核菌的檢出敏感性和定量結(jié)果。這個(gè)方法在幾乎沒有增加檢測(cè)成本的情況下，達(dá)到了較好的檢測(cè)效果，在經(jīng)濟(jì)條件有限的國(guó)家和地區(qū)值得進(jìn)一步推廣。

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