吳 炯，鄔升超 綜述，郭 瑋，潘柏申 審校

(上海復旦大學醫(yī)學院附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海200032)

華法林是用于防治靜脈和動脈血栓栓塞性疾病使用最為廣泛的抗凝藥物，主要適用于心臟瓣膜置換、房顫、深靜脈血栓和肺栓塞患者。華法林是一種消旋混合物，由兩種具有光學活性的同分異構體R型和S型等比例構成[1]。穩(wěn)定狀態(tài)下R-華法林的濃度是S-華法林的2倍，而S-華法林的抗凝作用則比R異構體強5倍。華法林價格低廉，小劑量即可起效，一旦發(fā)生用藥過量，使用維生素K可逆轉。華法林的臨床療效和不良反應個體差異很大，劑量難以掌握，如劑量不足會導致血栓，劑量稍大則會引起出血。對華法林天然耐藥的患者為達到理想的抗栓效應，通常需要應用常規(guī)劑量的5～20倍[1]。對于華法林藥效的影響的研究熱點集中在遺傳藥物基因組學，但除此之外華法林的藥效學還受其它如合并藥物(胺碘酮)、飲食習慣(高維生素K飲食)、凝血因子相關遺傳性疾病等一系列因素的影響。目前臨床多用定期監(jiān)測國際標準化比值(INR)和凝血酶原時間(PT)的方法監(jiān)測其藥效，及時調整劑量。

一、華法林代謝及作用原理

R-華法林的代謝主要是由細胞色素P450酶家族中的酶3A4、1A2和1A1完成。同工酶3A4可以代謝R-華法林，催化其成為無活性形式的10-羥基華法林。由于肝源性的細胞色素P450酶中，同工酶3A4占有很高的比例因此被認為是與R-華法林異構體代謝主要相關的酶類。S-華法林代謝主要是由細胞色素P450酶家族中的酶2C9完成，它可以代謝約80% ～85%的S-華法林，催化其成為無活性形式6-羥基或7-羥基華法林。約有45%的華法林最后代謝成為7-羥基華法林，參與該代謝途徑的細胞色素酶僅有細胞色素P450酶2C9(CYP2C9)[2]。由于華法林的抗凝作用主要由S-華法林貢獻，因此同工酶2C9的活性對華法林的抗凝效果產生顯著影響。華法林作用于維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體1(VKORC1)上，通過影響維生素 K循環(huán)代謝中的限速酶VKORC1的活性而起到在體內的抗凝作用。VKORC1活性直接決定了華法林的抗凝效果。

二、華法林相關基因

多項研究表明，華法林相關基因的單核甘酸多態(tài)性(SNPs)與個體所需華法林劑量有關，并與華法林使用過程中抗凝不足或者出血等副作用的發(fā)生相關。華法林藥物基因主要可以分為兩類，首先是與華法林作用代謝和作用靶點相關的基因，如CYP2C9和VKORC1等;其次是與體內維生素K1代謝循環(huán)相關的基因，如GGCX、CYP4F2、EPHX1、APOE等。上述酶類在華法林代謝和維生素K循環(huán)的作用見圖1。

1.CYP2C9 CYP2C9是編碼細胞色素P450酶2C9的基因，位于染色體10q24.2，全長55kb，由9個外顯子組成。由于CYP2C9編碼的酶2C9主要負責代謝華法林，CYP2C9基因突變可引起代謝華法林能力降低，降低所需的華法林使用劑量。目前報道最多的SNPs是野生型CYP2C9*1，突變型 CYP2C9*2(rs1799853)和 CYP2C9*3(rs1057910)。Lindh等[3]2009年針對 CYP2C9不同基因型對華法林維持劑量的影響進行Meta分析，較之于CYP2C9*1/*1型，攜帶CYP2C9*1/*2、CYP2C9*1/*3、CYP2C9*2/*2、CYP2C9*2/*3和CYP2C9*3/*3型的患者所需的華法林劑量分別要低 19.6%、33.7%、36.0%、56.7% 和78.1%。Sheng-Wen Huang 等[4]在針對中國漢族人群研究VKORC1和CYP2C9的基因多態(tài)性對于華法林劑量影響的研究中發(fā)現，基因型為CYP2C9*1/*3的患者平均每日華法林劑量為(1.72 ±0.55)mg/day，較之CYP2C9*1/*1 患者(3.09 ± 1.14)mg/day，其劑量要低 44.3%(P ＜0.001)，唯一的CYP2C9*3/*3型患者其平均每日華法林劑量僅為0.625 mg/day。CYP2C9的基因多態(tài)性分布存在種族差異，高加索人群中等位基因*1、*2和*3的頻率分別為83%、12%和5%，非洲人群97%、1%和2%，日本人群95%、0%和5%，而Miao等[5]對178例中國漢族人群的研究中發(fā)現該頻率分布為95.5%、0%和4.5%，即*1/*1、*1/*3 和*3/*3 患者分別為 162、16和0。在用藥初始階段，CYP2C9的多態(tài)性會引起2～3倍發(fā)生出血的概率[6]，在長期服用華法林的患者中并沒有出現以上現象。這提示在初始階段對于患者CYP2C9的SNPs的檢測有利于更好的防止出血事件的發(fā)生，但CYP2C9在初始階段對于華法林劑量的影響程度要小于VKORC1。

2.VKORC1 VKORC1是編碼維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體1的基因，位于染色體16p11.2，全長11Kb。VKORC1作為維生素K代謝循環(huán)中的限速酶，是華法林在體內作用的靶點，其編碼基因VKORC1的多態(tài)性會引起人體對于華法林的抵抗。Yang等[7]在針對VKORC1多態(tài)性分布和對于華法林劑量的影響進行了Meta分析，結果顯示VKORC1 1173 C＞T的分布同樣存在種族差異，高加索人群中等位基因 TT、CT、CC的頻率分別為16.3%、46.9%、36.8%，日本人群 84.9%、15.1%、0%，Jiang等[8]對102例中國漢族人群的研究中發(fā)現基因分布頻率分布為 81.4%、15.7%、2.9%。針對初始階段基因多態(tài)性對于華法林用藥患者的研究表明，VKORC1 1639攜帶AA型的患者較之于GG型可以更快的進入治療窗(INR≥2，P＜0.01)以及更低的穩(wěn)定劑量(P＜0.01)，但發(fā)生INR＞5的人數要高(P＜0.001)，初始治療期(1個月)內易發(fā)生出血事件(P ＜0.01)[9]，VKORC1 在華法林治療初期起著重要的影響作用。

3.CYP4F2 CYP4F2是編碼細胞色素P450家族酶4F2的基因。細胞色素P450酶CYP4F2是一種氧化酶，主要負責代謝體內維生素K1。其代謝產物為含有羥基的維生素K1。Matthew G.Mc-Donald等[10]的研究顯示通過篩查細胞色素酶，該代謝產物僅能通過CYP4F2的催化來產生。因此編碼CYP4F2的基因發(fā)生突變引起的酶活性的變化，會使體內維生素K含量的上升，最終導致華法林劑量的增加，目前和CYP4F2相關的SNP位點主要有 CYP4F2 V433M(rs21086222)。Cen 等[11]以222名中國漢族心臟瓣膜置換手術的患者為對象，研究CYP2C9*3，VKORC1和CYP4F2 V433M對于華法林穩(wěn)定劑量的影響，CYP4F2 V433M突變型患者的穩(wěn)定劑量為3.3 mg/day，要高于攜帶野生型等位基因 CC 的患者(CC，2.9 mg/day，P ＜ 0.05)。Danese等[12]針對 CYP4F2 V433M 的 Meta分析中提出CYP4F2 V433M的多態(tài)性和個體間華法林維持劑量的差異相關，攜帶T等位基因的患者所需抗凝藥物劑量高于純合子 CC型患者(8.3%，P＜0.000 1)，但是其對于華法林劑量的影響要低于VKORC1和CYP2C9。

4.GGCX γ-谷氨?；然甘怯蒅GCX基因所編碼的一種定位于粗面內質網和高爾基體上完整的微粒體膜酶，可使維生素K依賴性的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白 C、S、Z 上的 γ-谷氨酸殘基發(fā)生羧化，成為有活性的凝血因子參與凝血功能。當γ-谷氨?；然傅幕钚园l(fā)生變化，會直接引起凝血因子活化異常，最終導致所需華法林的劑量升高。主要報道的SNPs位點是GGCX 3261 G＞A(rs12714145)和 rs699664(p.R325Q)。Huang等[13]以212名服用華法林的中國漢族人為對象，研究GGCX 3261 G＞A基因多態(tài)性和華法林穩(wěn)定劑量的關系發(fā)現，84名攜帶GG型患者所需華法林劑量為(2.69±1.07)mg/d，顯著低于 16 名攜帶AA型等位基因的患者(3.39 ±1.40)mg/d，P=0.027。該突變可解釋2.3%個體間華法林差異。

5.EPHX1 微粒體環(huán)氧化物水解酶，是維生素K環(huán)氧化物還原酶的另一個亞單位，由EPHX1基因編碼。文獻報道該類酶具有維生素K環(huán)氧化物的 1個結合位點。Wadelius等[14]學者對于EPHX1 rs4653436在201名高加索人群中進行了研究，發(fā)現該位點與個體間華法林用藥差異具有相關性。Gu等[15]學者在127例中國漢族人群中驗證，GG、GA和AA型的人數分別為69例、53例和5例，并且發(fā)現華法林維持劑量存在明顯差異，AA型華法林穩(wěn)定劑量為(2.2±1.1)mg/d，GG和GA 型為(1.8 ±0.6)mg/d(P ＜0.05)。國內外學者針對該基因其他SNPS的研究還有EPHX1 rs1877724、rs2292566，但是針對中國漢族人群的研究主要集中在EPHX1 rs4653436。

表1 中國漢族人群華法林相關基因SNPs分布情況

三、華法林基因多態(tài)性的檢測

臨床上對于華法林基因多態(tài)性檢測的要求除了檢測結果的準確性之外，TAT和檢測費用是非常重要的2個方面。對于臨床實驗室，選用的基因多態(tài)性檢測方法決定了檢測儀器、試劑和耗材的選用，最終直接和上述標本周轉時間(TAT)和檢測費用相關。目前國內外對于華法林基因多態(tài)性檢測的位點主要有CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、VKORC1 1173(rs9934438)和 VKORC1 1639(rs9923231)。常規(guī)使用的檢測方法包括有直接測序法、高分辨熔解曲線(HRM)[26]、TaqMan 探針法和限制性片段多態(tài)性長度(PCR-RFLP)等。其中TaqMan探針法和直接測序法是國內外使用較多的2個檢測方法，TaqMan探針法的優(yōu)點是檢測快速，標本從收到全血到檢驗報告的發(fā)出在2 h內可以完成，但是其檢測費用較直接測序法要高。另一種方法是突變特異性擴增系統(tǒng)(ARMS)，其優(yōu)點包括方法靈敏且特異度好對于儀器和試劑的要求均較低，同時方法簡單，快捷。國內已經有學者建立了AMRS法對患者的華法林相關基因多態(tài)性進行檢測[27]。

四.華法林基因多態(tài)性的臨床應用

傳統(tǒng)的經驗化給藥方式的弊端在于需要多次檢測INR，并根據結果改變相應的華法林劑量，以至于長時間無法達到治療窗或易發(fā)生出血事件。因此美國國家食品和藥品監(jiān)管局(FDA)先在2007年在華法林藥品處方信息上添加了基因對于藥物療效的影響，之后于2010年修訂華法林的藥物處方信息，將基因對于華法林藥效的影響納入到考慮范圍內，提出醫(yī)師可以為患者提供基因檢測的機會，并提供了基于VKORC1和CYP2C9 2個基因的華法林劑量表格。上述措施均旨在強調基因對于華法林藥效的影響。近年來，許多研究團隊通過將基因型連同其它相關影響因素一起，建立了基于藥物基因組學的華法林劑量公式，并且以不同的方式包括前瞻性的隨機抽樣驗證和回顧性的驗證，就劑量公式的臨床價值進行了評估[29-30]。

圖1 華法林抗凝作用機制與維生素K1體內循環(huán)示意圖

2005 年 Sconce等[28]建立以年齡、身高、VKORC1和CYP2C9為影響因素的劑量公式“劑量=0.628-0.013 5(年齡)-0.240(CYP2C9*2)－0.370(CYP2C9*3)－0.241(VKORC1)+0.016 2(身高)”，這可以解釋約55%個體間華法林維持劑量的差異(R2=0.55)，作者通過回顧性研究的方式評估了該劑量公式的臨床價值，其預測的維持劑量和實際維持劑量具有很高的相關性(r=0.80，P＜0.001)。2009年Huang等[4]通過研究266 名中國漢族服用華法林劑患者基因多態(tài)性及其他相關因素對華法林維持劑量的影響，建立了基于VKORC1和CYP2C9的劑量公式，線性回歸模型可以解釋54.1%個體間華法林劑量差異。隨后針對156名中國漢族患者通過隨機分組的方式，對劑量公式進行了前瞻性驗證，結果顯示當患者華法林用藥劑量穩(wěn)定后，2組間華法林劑量呈現出相關性(R2=0.454，P ＜0.001)。隨后在 2012 年 Wang 等[30]通過將101例中國漢族的心臟瓣膜置換的患者分為2組(實驗組50名，對照組51名)，實驗組按照Huang等[4]建立的劑量公式進行，對照組以傳統(tǒng)給藥方式給藥，研究周期為50 d。結果顯示實驗組相對于對照組患者可以更快地從初始服藥階段進入維持劑量的服用階段[實驗組(27.5±1.8)d，對照組(34.7 ±1.8)d，P ＜0.001]，且2 組間華法林的維持劑量呈現出較好的相關性(r=0.684，P＜0.001)。2次前瞻性研究均給出了理想的結果，提示基于藥物基因學的劑量公式可以更好的指導華法林的使用。

上述針對華法林初期治療的前瞻性研究中，所給初始劑量都是基于維持劑量公式而計算得出的，而華法林用藥過程中，出血或者抗凝不足等不良事件往往發(fā)生在用藥初期，對于臨床而言初始劑量尤為重要。2011年Gong等[29]針對初次用藥患者以建立的“WRAPID”初始劑量公式進行了前瞻性研究，“WRAPID”包含了負荷劑量表格和維持劑量公式，其中負荷劑量即指在第一次服用華法林時給藥的劑量。該研究按照基于基因型的劑量表格在初次服藥的前2 d進行給藥，在給藥時按照不同的體重也對給藥劑量進行了矯正。最后結果說明“WRAPID”公式可以更好地為房顫和深靜脈血栓患者在服用華法林時提供幫助。這是迄今針對初始華法林用藥較為全面的1次前瞻性研究，但“WRAPID”中負荷劑量表格并沒有將年齡，或者其他相關基因的SNPS列為影響因素。

基于藥物基因學的劑量公式的建立，主要囊括了VKORC1，CYP2C9 2個基因的多態(tài)性位點和其他相關因素。但是由于許多其他基因如CYP4F2、EPHX1、GGCX等基因的多態(tài)性同樣會影響個體間華法林劑量的差異，因此也有許多研究將以上基因一同納入到劑量公式中，旨在更好地估計華法林劑量。Gu等[15]以127名中國漢族人群為對象，研究基因多態(tài)性及其他因素對于華法林維持劑量的影響。所涉及的基因包括VKORC1和CYP2C9外，還增加了EPHX1基因的1個多態(tài)性位點EPHX1 691A＞G(rs4653436)。通過多重線性回歸建立的模型包含年齡、體重、VKORC1-1639G＞A、EPHX1691A＞G、CYP2C9*3和CYP2C9 IVS3-65G＞C等影響因素，最終可以解釋76.8%個體間華法林劑量差異(R2=0.768)。

雖然華法林基因劑量方程的研究取得了不小的進展，但對于其臨床應用依然存在爭議。部分學者對于將華法林藥物基因學研究的臨床價值持樂觀態(tài)度。他們認為雖然使用之前納入年齡、體重、患病史、藥物和食物的影響的劑量方程可以縮短患者服藥后達到有效治療范圍(INR值控制在1.8～3.0之間)的時間[31]，但是通過將已經被公認和華法林劑量相關的CYP2C9和VKORC1基因的多態(tài)性一同列入到劑量方程，可以更好的指導患者在用藥初期避免抗凝過量的發(fā)生。據文獻報道，如果將基因型的檢測一同列入到華法林治療過程中，并按其結果指導用藥，美國服用華法林的患者每年可以避免4 500～22 000例嚴重出血事件的發(fā)生[32]。

但是有待解決的問題還是存在的，首先是如今的華法林劑量公式只能解釋50%高加索人種的個體用藥差異，對于亞洲和非洲人群，其所能解釋的程度要低很多，因此劑量公式中也許需要納入新的影響因素。另外，如何將建立的維持劑量公式作為初始劑量公式進行使用仍舊沒有定論，許多前瞻性研究均直接以維持劑量公式計算的結果作為初始給藥的劑量，其可行性尚未得到論證。最后要推廣以華法林藥物基因學為指導的給藥方式，需要更大規(guī)模的臨床實驗去驗證其可靠性。無論是支持用藥前進行基因多態(tài)性檢測的學者還是反對的學者均一致認為在初始階段基于藥物基因學的華法林劑量公式對于防范出血或者血栓形成發(fā)生的臨床價值有待更多隨機、大樣本、多種族的前瞻性研究去論證[33-34]。如果最后臨床驗證結果是可行的話，那么基于藥物基因學的華法林劑量公式將有效改善口服抗凝藥物的藥物治療安全性和成本效益

總之，在諸多耐藥相關基因中，華法林相關基因是研究較為多的1項，最有望成為個體化治療的切入點。但目前研究多以高加索人群為主，國內研究也多以維持劑量的回顧性研究較多，涉及基因不全面，沒有涵蓋初始及維持劑量的基因—劑量方程及前瞻性驗證。仍需進一步的研究，更有效、安全地為中國服用華法林的患者合理使用華法林提供幫助。

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