樊文娜，孫曉格，倪俊霞，杜紅旗，史瑩華，嚴(yán)學(xué)兵，王成章

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002)

苜蓿(Medicago sativa)為長日照植物，秋冬短日照下休眠，說明苜蓿秋眠(fall dormancy，F(xiàn)D)存在著光周期效應(yīng)［1-3］。不同苜蓿品種對低溫和短日照的反應(yīng)有差異，據(jù)此可將其分為秋眠型(fall dormancy，1～3級)、半秋眠型(semi-fall dormancy，4～6級)和非秋眠型(non-fall dormancy，7～9級)3種類型［4］。秋眠型苜蓿夏末和早秋即進(jìn)入休眠，停止生長時間早，秋季產(chǎn)量低;非秋眠型苜蓿秋季休眠晚，只要溫度等條件適宜，仍可繼續(xù)旺盛生長，有較高的秋季產(chǎn)量;半秋眠型苜蓿正好介于二者之間［5-6］。

據(jù)研究，植物感受和測量日照長短是通過葉片中的光受體完成的。在植物的光形態(tài)建成中，光敏色素是主要的光受體。對擬南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的研究表明，雙子葉植物中至少存在5種不同的光敏色素基因，即 PHYA、PHYB、PHYC、PHYD 和 PHYE［7］，光敏色素 A(phytochrome A，PHYA)和光敏色素 B(phytochrome B，PHYB)是主要的光敏色素，在植物的生長發(fā)育中有重要作用［8］，植物的種子萌發(fā)、生長、開花和休眠等生長發(fā)育過程與其密切相關(guān)［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，植物的光受體信號基因往往是通過其內(nèi)源激素傳遞給靶基因從而調(diào)控其生長發(fā)育的［10-11］。既然光周期是影響苜蓿秋眠性的主要環(huán)境因子，秋季日照長度的變化就可能通過光受體基因PHYA、PHYB的表達(dá)和植物激素的合成調(diào)控其休眠，因此研究不同秋眠型苜蓿PHYA、PHYB的表達(dá)量和植物激素含量能在很大程度上探明其與苜蓿秋眠性的關(guān)系。

光敏色素和內(nèi)源激素在調(diào)控苜蓿秋眠性上可能有互作關(guān)系，PHYB(或PHYA)調(diào)節(jié)脫落酸 (abscisic acid，ABA)、赤霉素3(gibberellin，GA)等植物內(nèi)源激素的生成、轉(zhuǎn)化和代謝以及植物對ABA、GA3等的敏感程度，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育。GA3與ABA是2個對植物生理作用相反的激素，ABA能促進(jìn)秋眠，GA3有解除秋眠的作用，噴灑外源ABA能促進(jìn)內(nèi)源ABA的累積，有利于苜蓿的秋眠［11］。由于ABA能誘導(dǎo)抗寒等逆境基因的表達(dá)，因此在短日照處理下ABA水平增加，可能會加強(qiáng)苜蓿秋眠基因的誘導(dǎo)與表達(dá)，從而調(diào)控和促進(jìn)秋眠。內(nèi)源激素可能是調(diào)節(jié)秋眠性的化學(xué)信使，GA3/ABA、生長素 (indole acetic acid，IAA)/ABA和玉米素核苷(zeatinR，ZR)/ABA的變化可反映促進(jìn)生長的激素和抑制生長的激素之間的相對平衡狀態(tài)，PHYB作為綠色植物主要光受體可能通過光周期調(diào)控激素合成和其平衡進(jìn)而調(diào)控或參與了苜蓿的秋眠［11-14］，因此，PHYA、PHYB以及植物激素之間的關(guān)系用以研究苜蓿秋眠性機(jī)理有重要意義。

本研究的目的在于探討不同光周期條件下不同秋眠型苜蓿PHYA、PHYB mRNA的表達(dá)量，揭示日照長度與不同秋眠型苜蓿光受體基因表達(dá)之間的關(guān)系;測定內(nèi)源激素含量與光受體基因表達(dá)之間有無互作關(guān)系。從而為揭示苜蓿秋眠性的調(diào)控機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗設(shè)計

選取苜蓿秋眠性標(biāo)準(zhǔn)對照品種Norseman(FD1)、Dupuils(FD5)和 CUF101(FD9)，于2009年9月20日種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)牧草試驗地，2010年8月20日選擇生長健壯、均勻一致的苜蓿植株移植于花盆(24 cm×24 cm)中，待其成活后轉(zhuǎn)入人工氣候室。實(shí)驗設(shè) 7 h/d、10 h/d(SD，短，short day)、13 h/d(MD，中，middle day)和 16 h/d(LD，長，long day)光照處理，每個處理重復(fù)6次，定時定量澆水。溫度設(shè)置為:光照20℃/黑暗10℃，處理35 d。隨機(jī)摘取各株頂芽及上部葉片，無菌錫箔紙包裹，立即由液氮固定，并轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存待用。為接近自然光質(zhì)的能量和輻射強(qiáng)度，采用全光譜燈和LED燈，光照設(shè)備由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李志剛老師設(shè)計并提供(圖1)。

圖1 全光譜的光譜能量分布圖Fig.1 Plant lights spectral energy distribution of the full spectrum

1.2 PHYA、PHYB 引物設(shè)計

引物參考本實(shí)驗室提供的PHYA、PHYB基因全長［15-17］設(shè)計，通過熒光定量PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))測定其mRNA表達(dá)量。

PHYA-s:5'-GAGAGATAGCTTTATGGATGTCTGAGT-3'(27 bp)，PHYA-a:5'GCGACCTAAACCAG-AAAACTATG T-3'(24 bp)，PHYA 的擴(kuò)增片段長度為 168 bp;PHYB-s:5＇-GTAGAGGACGCTATGGGGAAGT-3'(22 bp)，PHYB-a:5'-TGGAGCAAGCATTCACCACTAT-3'(22 bp)，PHYB的擴(kuò)增片段長度為146 bp。

1.3 RNA的提取及PCR檢測

將紫花苜蓿葉片迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉狀，按照RNA提取試劑(Takara，RNAiso Plus)上的操作說明提取總RNA。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看到RNA 28S和18S的條帶清晰，28S為18S的2倍，RNA完整性良好。取總RNA 2 μL在微量核酸檢測儀上檢測質(zhì)量，OD260/280值均在1.8～2.0之間，RNA質(zhì)量好，純度高。對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到168和146 bp大小的產(chǎn)物(如圖3)。

1.4 PHYA、PHYB 片段克隆測序

提取苜蓿中總RNA，以此為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對目的片段進(jìn)行切膠、純化回收，將2個基因分別與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白菌落進(jìn)行初步篩選，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)，然后將含pGM-T-PHYA、PHYB質(zhì)粒的菌液送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序、鑒定。

圖2 紫花苜?？俁NA提取結(jié)果Fig.2 Detection of total RNA in alfalfa

圖3 PHYA和PHYB PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of PHYA and PHYB fragments

通過測序分析，其結(jié)果與設(shè)計引物所用模板序列完全一致，NCBI中比對分析的結(jié)果與紫花苜蓿品種WL-525HQ的PHYA、紫花苜蓿品種Vernal的PHYB基因序列一致，說明由引物得到的PHYA、PHYB的RT－PCR產(chǎn)物與目的基因相符。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算方法

提取PHYA、PHYB的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒制備后，用紫外分光光度計對質(zhì)粒模板進(jìn)行定量并梯度稀釋成 1011，1010，109，108，107，106，105，104拷貝/μL，作為陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時熒光定量系統(tǒng)對收獲的PHYA和PHYB的cDNA的拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量，并根據(jù)測定結(jié)果，計算出光敏色素在不同光周期條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線［18-21］。根據(jù)公式和重組質(zhì)粒的分子量計算出標(biāo)準(zhǔn)品核酸的摩爾濃度，然后依據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)6.02×1023換算成該質(zhì)粒核酸每微升拷貝數(shù)(copy/μL)。PHYA的質(zhì)粒拷貝數(shù)為4.08×1010拷貝/μL;PHYB的質(zhì)?？截悢?shù)為5.11 ×1010拷貝/μL。PHYA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 yA= －3.43x+45.85，相關(guān)系數(shù)為0.999;PHYB 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 yB= －3.26x+46.90，相關(guān)系數(shù)為0.998。

在每份樣品中檢測PHYA、PHYB的CT值(PCR反應(yīng)每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，并進(jìn)行3次PCR重復(fù)，取3次PCR CT值的平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算定量結(jié)果，計算校正值。

1.6 PHYA、PHYB 反應(yīng)條件的優(yōu)化

光周期實(shí)驗中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的配制及其反應(yīng)條件如下:25 mmol/L硫酸鎂2 μL，緩沖液5 μL，無酶水0.75 μL，DNA 聚合酶的底物(10 mmol/L)0.5 μL，RNA 酶抑制劑 RNase Inhibitor(40 U/μL)0.25 μL，反轉(zhuǎn)錄酶(22 U/μL)0.5 μL，隨機(jī)引物 0.5 μL，陽性對照 RNA 0.5 μL，共10 μL。反應(yīng)體系SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μL，PCR 上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，PCR 下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，熒光染料(50 × )0.4 μL，DNA模板2.0 μL，無酶水6.8 μL，共 20 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)參數(shù)為95℃30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40 個循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行熔解曲線分析，94℃ 1 min，60℃ 1 min，以0.10℃/s的速度升溫到92℃，連續(xù)監(jiān)測熒光。

1.7 植物激素的測定方法

在同時間內(nèi)隨機(jī)摘取各處理每株頂芽及上部葉片1 g左右，無菌錫箔紙包裹，立即由液氮固定，并轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存待用。激素的測定采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays，簡稱ELISA)，ELISA試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化學(xué)控制中心提供。酶標(biāo)儀的型號為Thermo Multiskan MK3。每個樣品測定3次重復(fù)，取其平均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

由圖4，圖5可知，隨著光照時間的增長，3種秋眠類型苜蓿品種葉片中的PHYA、PHYB mRNA表達(dá)量均成下降態(tài)勢。3種不同秋眠類型比較，PHYA表達(dá)量均隨著苜蓿秋眠性的下降依次降低(7 h/d除外);秋眠型苜蓿和非秋眠型苜蓿PHYB mRNA表達(dá)量在不同光周期條件下，也有隨著苜蓿秋眠性的下降而依次降低的趨勢，但半秋眠型苜蓿這種規(guī)律性不明顯。

由表1可知，隨著光照時間的延長，3種秋眠類型苜蓿的GA3含量基本上均呈上升趨勢，其中Norseman變化趨勢最為明顯，各處理之間差異都極顯著;同一個光照時間不同秋眠類型GA3含量之間無規(guī)律性，但Norseman GA3含量高于Dupuils和CUF101。

ABA含量的變化趨勢正好與GA3相反，隨著光照時間的延長，無論是秋眠型苜蓿Norseman、半秋眠型苜蓿Dupuils，還是非秋眠型苜蓿CUF101，均呈依次下降的趨勢，且不同光照處理間差異均極顯著，其中尤以Norseman ABA的含量變幅最大。同一個光照時間不同秋眠類型ABA含量比較，無論哪一個日照長度，均呈現(xiàn)出Norseman＞Dupuils＞CUF101，且差異顯著。

3種秋眠類型苜蓿的ZR含量并無規(guī)律性，但以Dupuils的最高。對IAA的含量來說，每一個秋眠類型品種都有隨著光照時間的延長而提高的趨勢(個別時間除外)，且差異顯著;除7 h/d的光照處理外，其余光照時間處理均Norseman＜Dupuils＜CUF101，大部分都達(dá)到了差異極顯著程度。

圖4 光照對不同秋眠型苜蓿PHYA mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 Photoperiod effect on PHYA mRNA expression of alfalfa with different fall-dormancy

圖5 光照對不同秋眠型苜蓿PHYB mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 Photoperiod effect on PHYB mRNA expression of alfalfa with different fall-dormancy

表1 光周期對不同秋眠型紫花苜蓿內(nèi)源激素含量的影響Table 1 Photoperiod effect on endogenous hormones of alfalfa with different fall-dormancy

由圖6可知，隨著光照時間的遞增，GA3/ABA、ZR/ABA和IAA/ABA都有依次上升趨勢。各光照處理下，3個比值的峰值都在16 h/d，且變化趨勢明顯。

圖6 光周期對不同秋眠級紫花苜蓿GA3/ABA、IAA/ABA和ZR/ABA的影響Fig.6 Photoperiod effect on GA3/ABA，ZR/ABA and IAA/ABA of alfalfa with different fall-dormancy

3 討論

秋眠是一種特殊的休眠方式，即內(nèi)生性休眠。目前，休眠在生理方面得到廣泛的研究［22-24］，苜蓿基因克隆和功能組學(xué)的研究日漸深入［25-28］，但苜蓿休眠的調(diào)控機(jī)理研究仍有很多空白。

大量研究表明，植物的休眠受光周期的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。短日照誘導(dǎo)植物的休眠在楊樹(Populus tomentosa)、葡萄(Vitis vinifera)、狗木(Cornus sericea)等樹木中得到了證實(shí)［29-32］，其中PHYA和PHYB的表達(dá)在光信號通路中發(fā)揮著重要作用，擬南芥中96%光誘導(dǎo)的基因是通過PHYA和PHYB來調(diào)節(jié)的［33-34］，短日照條件下，PHYA的超表達(dá)抑制休眠誘導(dǎo)，通過改變?nèi)照臻L度能改變其休眠反應(yīng)［30，32］。Kuhn 等［34］的試驗證明，光周期調(diào)控了葡萄葉中PHYA和PHYB mRNA表達(dá)量，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了葡萄的休眠，PHYA和PHYB含量在正常生長季節(jié)不穩(wěn)定，一旦被轉(zhuǎn)移至短日照誘導(dǎo)休眠的條件下，不穩(wěn)定的表達(dá)現(xiàn)象都停止，取而代之的是表達(dá)量均增加［34-35］。王成章等［10］通過研究不同光周期對苜蓿秋眠性的影響結(jié)果表明，秋眠型苜蓿短日照條件下PHYB的蛋白表達(dá)量最高，推測其含量多寡程度不同調(diào)控了光周期反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)了休眠。本實(shí)驗結(jié)果顯示，3個不同秋眠類型苜蓿品種基本都是在短日照條件下葉片中的PHYA和PHYB mRNA表達(dá)量高，秋眠特征明顯，可能的原因是:苜蓿為長日照植物，短日照為苜蓿生長創(chuàng)造了較強(qiáng)的逆境效應(yīng)，苜蓿為應(yīng)對這種不良的環(huán)境刺激，通過加速PHYA和PHYB合成，誘導(dǎo)苜蓿進(jìn)入秋眠。尤其短日照條件下1級品種Norseman即秋眠型苜蓿品種PHYB表現(xiàn)最為明顯，合成量也最大，隨著光周期的延長，PHYB的含量直線下降，秋眠型苜蓿PHYB mRNA合成量明顯高于半秋眠型、非秋眠型苜蓿，顯示了PHYA和PHYB可能在苜蓿秋眠性中發(fā)揮了重要作用。

在植物的自然休眠中，內(nèi)源激素是一個十分重要的影響因子，多數(shù)研究認(rèn)為，內(nèi)源激素參與了休眠的誘導(dǎo)、維持與終止。GA3與ABA在休眠中的作用相反，ABA能促進(jìn)休眠，GA3有解除休眠的作用，但GA3能促進(jìn)ZR、IAA的生物合成，且ABA的作用只有在其他內(nèi)源激素的密切配合下才能表現(xiàn)出來［36］。休眠不僅與植物內(nèi)源激素的絕對含量有關(guān)，還與各類激素之間的平衡，特別是促進(jìn)生長的激素與抑制生長的激素之間的比例及平衡有關(guān)［37］。本試驗測定了IAA、ABA、ZR、GA3的含量，結(jié)果表明，7 h/d光照時間GA3/ABA、ZR/ABA和IAA/ABA均為最低，可能是短日照條件下苜蓿的生長被抑制和休眠較強(qiáng)的原因;隨著光照時間的延長，GA3/ABA、ZR/ABA和IAA/ABA依次增大，其中3種秋眠類型苜蓿3種激素比值均以16 h/d最高，可能是長日照條件下苜蓿休眠被解除、生長被促進(jìn)的原因。

植物的光形態(tài)建成中，在接受光周期信號后，光受體基因通過改變植物內(nèi)源激素的含量進(jìn)而調(diào)控靶基因發(fā)揮作用［38-44］，ABA、GA3和 IAA 被包含在光形態(tài)建成中。Mazzella等［45］、Seo等［46］證明 PHYB 直接或間接調(diào)控了ABA合成，進(jìn)而影響擬南芥的休眠;王成章等［10］的研究表明，在短日照條件下，苜蓿的秋眠是通過促進(jìn)PHYB蛋白的合成進(jìn)而增加ABA的合成量來實(shí)現(xiàn)的，其中秋眠型苜蓿在短日照條件下的PHYB和ABA的合成量顯著高于半秋眠苜蓿和非秋眠苜?？赡苁瞧淝锩咴缜覐?qiáng)的原因之一。本研究中，短日照條件下苜蓿葉片中PHYA、PHYB mRNA表達(dá)量和ABA含量顯著高于長日照與王成章等［10］不同光周期條件下PHYB蛋白水平的表達(dá)研究結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明在不同光周期條件下，光敏色素和植物內(nèi)源激素可能參與了苜蓿的光形態(tài)建成，PHYA和PHYB直接或間接調(diào)控植物內(nèi)源激素GA3、ZR、IAA、ABA的合成，進(jìn)而調(diào)控了苜蓿的秋眠。

4 結(jié)論

在短日照條件下，ABA和PHYA、PHYB mRNA的表達(dá)量或合成量增加，GA3、ZR、IAA的合成量下降，可能PHYA、PHYB在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接影響了內(nèi)源激素GA3、ZR、IAA、ABA的合成，進(jìn)而調(diào)控了苜蓿的秋眠。

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