徐國強(qiáng) 徐鵬武 施冬健 陳明清

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

自Novoselov和Geim等[1]制備出單層石墨烯以來，其在電化學(xué)、傳感器和復(fù)合材料等領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[2]。石墨烯有大的比表面積，可通過范德華力、π-π堆疊等非共價(jià)鍵合作用高效吸附芳香族化合物[3-4]，因此作為載體也成為研究熱點(diǎn)。氧化石墨烯(GO)表面隨機(jī)分布著大量的羥基、羧基和環(huán)氧基等含氧官能團(tuán)，較石墨烯有更好的親水性[5]，經(jīng)功能分子的共價(jià)修飾可實(shí)現(xiàn)其在特定領(lǐng)域的應(yīng)用[6-9]。熒光素(Flu)的量子產(chǎn)率高且激發(fā)與發(fā)射波長范圍廣，適用于熒光標(biāo)記和探針[10]，GO可作為熒光物質(zhì)的載體用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[11-14]。Flu與GO的非共價(jià)鍵合作用會(huì)引起熒光猝滅[15-16]，因此以聚乙二醇(PEG)橋接GO和Flu防止熒光猝滅，增強(qiáng)GO基熒光探針的溶液分散穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像。

本工作將不同分子量的PEG在相同的反應(yīng)條件下接枝到GO表面，研究PEG的接枝量對(duì)GOPEG分散穩(wěn)定性的影響；以GO-PEG為載體，探討PEG的接枝量對(duì)Flu負(fù)載量的影響，考察Flu/GOPEG6000在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的釋放行為；以接枝PEG鍵合Flu，觀察GO-PEG6000-Flu的細(xì)胞成像效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

氧化石墨，實(shí)驗(yàn)室制備；透析袋 (MWCO=14 kDa)，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、熒光素、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙二醇(PEG1000、PEG2000和 PEG6000)均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和4-甲氨基吡啶(DMAP)均為分析純，購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；HepG2肝癌細(xì)胞購于上海博谷生物科技有限公司。

所用儀器有：FALA2000-104型傅里葉變換紅外光譜儀 (加拿ABB Boman公司)，InVia型拉曼光譜儀(英國Renishaw公司)，UV-1100型紫外-可見分光光度計(jì) (北京瑞利分析儀器公司)，RF-5301PC熒光光譜儀(日本島津公司)，TGA-1100SF型熱重分析儀(瑞士Mettler-Toledo公司)，S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)，DB-525型zeta電位及粒度分析儀(美國Brookhaven公司)，LSM710型共聚焦激光顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.2 GO-PEG的制備

取Hummers法[9]制備的氧化石墨在DMF中超聲分散，得到1 mg·mL-1的分散液，將100 mg PEG1000、200 mg PEG2000和 600 mg PEG6000分別與 50 mL分散液加入100 mL圓底燒瓶中超聲10 min，再加入一定量DCC/DMAP(物質(zhì)的量的比5∶1)，超聲30 min后在60℃下反應(yīng)12 h，將分散液裝入透析袋中透析1周，除去游離的PEG和催化劑，經(jīng)冷凍干燥得GO-PEG。

1.3 Flu/GO-PEG的制備

在 5 mL 不同濃度(3.2～28.8 μg·mL-1)的 Flu 溶液中加入0.5 mL GO水分散液(0.1 mg·mL-1)，室溫下攪拌24 h。離心30 min后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出上層清液中未負(fù)載的Flu，進(jìn)而計(jì)算出Flu在GO上的負(fù)載量。以相同的方法計(jì)算出Flu在GO-PEG的負(fù)載量。

1.4 Flu的釋放

將Flu/GO-PEG6000裝入透析室中，置于盛有20 mL不同pH值(5、7.2和9.18)磷酸鹽緩沖液(PBS)的燒杯中，在37℃恒溫下透析3 d，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)從燒杯中取出3 mL PBS，并立即補(bǔ)充3 mL PBS，在475 nm波長下測(cè)定取出溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Flu的釋放率。

1.5 GO-PEG6000-Flu的制備

取 1 mg·mL-1GO-PEG6000的 DMF 分散液、5 mg Flu 和 DCC/DMAP (物質(zhì)的量的比 2∶5∶1) 裝入 100 mL圓底燒瓶，超聲20 min后置于60℃下反應(yīng)24 h，將體系透析一周，經(jīng)冷凍干燥得到GO-PEG6000-Flu。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

37℃、5%CO2條件下，在盛有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，將30 μg·mL-1GO-PEG6000、Flu/GO-PEG6000和 GO-PEG6000-Flu 分 別加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞移植到24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，用PBS漂洗3次，將細(xì)胞置于載玻片上，加90%甘油-PBS封片，于共聚焦激光顯微鏡(CLSM)下觀察(激光波長460 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO-PEG的結(jié)構(gòu)與形貌表征

圖1為GO(a)和GO-PEG(b～d)的紅外譜圖。GO在～3 400 cm-1附近吸收峰較寬，包含COOH和O-H的吸收，～1 718 cm-1處峰為C=O的伸縮振動(dòng)峰。經(jīng)PEG 修飾后，～2 880 cm-1和～1 095 cm-1處出現(xiàn)了PEG的C-H和C-O的振動(dòng)吸收峰，～1 724 cm-1處為接枝PEG后形成酯鍵的振動(dòng)峰，～1 248 cm-1處為PEG的C-O-C的非對(duì)稱彎曲振動(dòng)，表明PEG接枝成功。

圖1 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000的紅外譜圖Fig.1 FTIR spectra of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GOPEG2000and(d)GO-PEG6000

圖2 (a)石墨、(b)GO、(c)GO-PEG1000、(d)GO-PEG2000和(e)GO-PEG6000的拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of(a)Graphite,(b)GO,(c)GOPEG1000,(d)GO-PEG2000and(e)GO-PEG6000 under a laser excitation wavelength of 532 nm

圖2是石墨(a)、GO(b)和 GO-PEG(c～e)的拉曼光譜圖。1 350 cm-1、1 579～1 605 cm-1附近的峰分別代表D帶和G帶。相較石墨，GO的G帶變寬并發(fā)生藍(lán)移，ID/IG明顯增加，原因是石墨的氧化過程降低了石墨層的sp2雜化程度，使石墨層的缺陷和混亂程度增加，藍(lán)移由孤立的雙鍵引起[17-20]。GO-PEG的ID/IG與GO相比略有增大，但總體變化不大，表明PEG的接枝對(duì)其面內(nèi)sp2領(lǐng)域大小的影響不大。

GO和GO-PEG的 TGA曲線(圖 3)顯示，GO(a)在N2氣氛下低于100℃的熱失重歸因于水分的蒸發(fā)，～160℃處顯著的熱失重歸因于GO表面含氧官能團(tuán)的熱分解[19]。 GO-PEG(b～d)在～200 ℃為表面剩余含氧官能團(tuán)的熱失重，250～400℃為接枝PEG的熱失重，根據(jù)其熱失重的變化，可計(jì)算出PEG的接枝量與接枝密度[21]分別為14.2%、18個(gè)PEG1000鏈/10000 碳 (b)，52.5%、66 個(gè) PEG2000鏈/10000 碳(c)，68.4%、43個(gè) PEG6000鏈/10000碳(d)。

圖3 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000的TGA曲線Fig.3 TGA curves of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GOPEG2000and(d)GO-PEG6000in nitrogen

圖4(a)顯示經(jīng)超聲剝離所得GO是徑厚比較大的卷曲的薄片，但仍有一定程度的聚集。經(jīng)PEG修飾后，PEG對(duì)GO片層間的范德華力和氫鍵的弱化作用有利于GO片層的剝離與延展以及阻止GO的聚集[22-23]，所以 GO-PEG 的形貌(圖 4b～d)及靜置狀態(tài)下的分散穩(wěn)定性發(fā)生了明顯的變化(圖5)。GO-PEG剝離程度高于GO；GO-PEG6000分散穩(wěn)定性最佳，30天仍可穩(wěn)定分散在PBS中(圖5d)，表明產(chǎn)物的分散穩(wěn)定性與接枝量呈一定的正相關(guān)。

圖4 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM images of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GOPEG2000and(d)GO-PEG6000

2.2 GO-PEG的負(fù)載功能

圖5 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000在PBS中的分散穩(wěn)定性(1 mg·mL-1)Fig.5 Stability of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GO-PEG2000 and(d)GO-PEG6000in PBS(1 mg·mL-1),photograph of samples on selected time(inset)

圖6中a→h的變化趨勢(shì)表明隨著GO-PEG6000用量的增大，由Flu與GO-PEG6000的碳平面間的非共價(jià)鍵合作用引起的熒光猝滅作用逐漸增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度逐漸減弱。GO和GO-PEG對(duì)Flu的負(fù)載量如圖 7 所示，F(xiàn)lu 濃度達(dá)到 28.8 μg·mL-1時(shí)，其負(fù)載量在 1.4～1.9 mg·mg-1，高于許多負(fù)載體系[4,24]。GO 具有最大的負(fù)載量；經(jīng)PEG修飾后，GO-PEG的負(fù)載量受其表面接枝量的影響而不同，其中GO-PEG1000的接枝量最小，載藥面積受影響程度最小，對(duì)Flu的負(fù)載量達(dá) 1.75 mg·mg-1。

圖6 GO-PEG6000用量增加對(duì)Flu溶液熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Fluorescence intensity of Flu solution as a function of GO-PEG6000amount(from a to h:10,30,50,70,90,100,110 and 120 μL),with the excitation wavelength of 460 nm

圖7 不同F(xiàn)lu濃度下載體的負(fù)載量Fig.7 Loading capacity of carriers in different Flu concentrations,standard curve of Flu(inset)

圖8 Flu/GO-PEG6000的釋放行為Fig.8 Release behaviors of Flu/GO-PEG6000

通過分散穩(wěn)定性(圖5)和負(fù)載(圖7)實(shí)驗(yàn)可知，GO-PEG6000兼具良好的分散穩(wěn)定性與負(fù)載性能，因此以Flu/GO-PEG6000為研究對(duì)象，其在37℃、不同pH值PBS中的釋放行為如圖8所示。在不同pH值條件下，起始階段均具有較快的釋放速率，12 h后釋放速率放緩；堿性條件下具有更快的釋放速率，其原因是Flu的羥基和羧基與載體表面殘留羧基及羥基間的氫鍵作用受到破壞，而酸性與中性環(huán)境對(duì)此類氫鍵的影響較小，這與模型藥物羅丹明在石墨烯基負(fù)載上呈現(xiàn)的pH響應(yīng)釋放相異[3,14]。Flu可作為一種模型藥物為研究結(jié)構(gòu)類似藥物的pH響應(yīng)釋放提供一定的理論支持。

2.3 GO-PEG6000-Flu的細(xì)胞成像功能

圖9 (a)GO-PEG6000-Flu，(b)GO-PEG6000和(c)Flu的紅外譜圖Fig.9 FTIR spectra of(a)GO-PEG6000-Flu,(b)GO-PEG6000 and(c)Flu

圖10 GO-PEG6000-Flu的尺寸分布Fig.10 Size distribution of GO-PEG6000-Flu,SEM image of GO-PEG6000-Flu(inset)

圖11 (a)Flu、(b)GO-PEG6000-Flu、(c)Flu/GO-PEG6000和(d)GO-PEG6000水溶液的熒光光譜Fig.11 Fluorescence spectra of(a)Flu,(b)GO-PEG6000-Flu,(c)Flu/GO-PEG6000and(d)GO-PEG6000 solution,photograph of samples(inset)

圖9為GO-PEG6000-Flu(a)和Flu(b)的紅外譜圖。a譜線中，944 cm-1、843 cm-1處出現(xiàn)歸屬于Flu芳環(huán)中C-O-C和C=C的特征峰，另外，相較于GOPEG6000，F(xiàn)lu的鍵合引入了新的 C=O，可以看到～1 724 cm-1處IC=O明顯增強(qiáng)，可表明GO-PEG6000-Flu合成成功。經(jīng)多次離心分離、超聲分散后可得到尺寸較小的GO-PEG6000-Flu分散液(圖10)，其熒光發(fā)射光譜如圖11(b)所示，與Flu(a)相比發(fā)生了～10 nm的紅移，而Flu/GO-PEG6000(c)發(fā)生了熒光猝滅；表明PEG的橋接有效防止了GO片層對(duì)Flu的熒光猝滅作用，同時(shí)導(dǎo)致發(fā)射波長發(fā)生轉(zhuǎn)變，有望作為一種熒光探針。為了考察GO-PEG6000-Flu熒光探針的細(xì)胞成像功能 ， 將 GO-PEG6000、Flu/GO-PEG6000、GOPEG6000-Flu分別加入HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液。通過CLSM對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖12所示。攝入Flu/GO-PEG6000的HepG2細(xì)胞因其熒光猝滅作用導(dǎo)致熒光顯像不清晰(B1，B3)，攝入 GO-PEG6000-Flu的細(xì)胞熒光顯像效果較顯著(C1，C3)，能較清晰地看到細(xì)胞，表明探針通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，該探針具有較好的細(xì)胞相容性，在測(cè)試過程中未見明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

圖12 (A)GO-PEG6000、(B)Flu/GO-PEG6000和(C)GOPEG6000-Flu標(biāo)記的HepG2細(xì)胞的CLSM圖片,1表示暗場(chǎng),2表示明場(chǎng),3表示明暗場(chǎng)重疊Fig.12 CLSM images of HepG2 cells incubated with(A)GO-PEG6000,(B)Flu/GO-PEG6000and(C)GOPEG6000-Flu,Dark-field(1),bright-field(2)and overlap of the two fields(3),scale bar:20 μm

3 結(jié) 論

GO-PEG具有良好的水分散穩(wěn)定性，與PEG的接枝量呈一定的正相關(guān)；GO-PEG對(duì)Flu具有較高的負(fù)載能力，負(fù)載量受接枝量影響，其釋放行為具有pH值觸發(fā)釋放性能；GO-PEG6000-Flu作為一種熒光探針具有較好的細(xì)胞成像功能。

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