喬付杰 李俊樂 高 惠 滕麗微，2 王繼飛 劉振生，2*

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動物保護學重點開放實驗室，哈爾濱，150040；3.寧夏賀蘭山國家級自然保護區(qū)管理局，銀川，750021)

阿拉善馬鹿(Cervuselaphusalxaicus)是馬鹿(C.elaphus)的一個亞種，為國家Ⅱ級重點保護野生動物[1]。馬鹿屬偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Ceridae)鹿亞科(Cervinae)，我國分布有8個馬鹿亞種，分別為天山亞種(C.e.songaricus)、塔里木亞種(C.e.yarkandensis)、阿爾泰亞種(C.e.sibiricus)、甘肅亞種(C.e.kansuensis)、阿拉善亞種(C.e.alxaicus)、四川亞種(C.e.macneilli)、西藏亞種(C.e.wallichi)和東北亞種(C.e.xanthopygus)[2]。阿拉善馬鹿目前僅分布于寧夏和內(nèi)蒙古交界的賀蘭山中段，是我國唯一幸存的該亞種的有效種群[2-4]，劉振生等[5-6]和駱穎等[7]已對賀蘭山地區(qū)阿拉善馬鹿的生境選擇進行了較為詳細的研究，高惠等就該地區(qū)阿拉善馬鹿的生境適宜性做了評價[8]。但目前關于野生阿拉善馬鹿的分子研究尚屬空白。

線粒體DNA是母系遺傳，具有分子量小，進化速度快等特點。其Cytb區(qū)基因的進化速度適中，一個較小的基因片段就包含著從種內(nèi)到種間的遺傳進化信息[9]，對種群遺傳多樣性有很重要的作用。本文對采自賀蘭山的野生阿拉善馬鹿糞便樣本進行DNA提取、線粒體Cytb區(qū)DNA序列測定和分析，分析該物種的遺傳變異和其他中國分布的馬鹿亞種的遺傳分化，為其遺傳多樣性保護提供科學依據(jù)，對該物種的合理管護、促進種群發(fā)展具有重要意義。

1 研究地概況

賀蘭山位于寧夏回族自治區(qū)和內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處(38°21′—39°22′ N，105°49′—106°42′ E)，由內(nèi)蒙古賀蘭山國家級自然保護區(qū)和寧夏賀蘭山國家級自然保護區(qū)組成。海拔一般為2 000—3 000 m，為典型的大陸性氣候，植被依據(jù)海拔的上升呈明顯的垂直分異，自下而上依次為山地草原帶(1 400—1 600 m)，山地疏林草原帶(1 600—2 000 m)，山地針葉林帶(1 900—3 000 m)，亞高山灌叢和草甸帶(3 000—3 556 m)[10]。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與DNA提取

在2016年8—9月和2017年2—3月在賀蘭山地區(qū)采集馬鹿野生群體的新鮮糞便樣本396份(圖1)。采集時使用一次性PE手套，防止交叉污染，并用手持GPS定位。采集的糞便倒入無水乙醇保存，運回實驗室后冷凍保存。使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒提取DNA，具體實驗方法見試劑盒詳細使用說明書，將提取好的DNA分成兩份，一份放置于-20℃用于下一步的擴增使用，一份放置于-80℃凍存。

圖1 研究區(qū)域與采樣點Fig.1 Study area and sampling points

2.2 物種鑒定

PCR擴增線粒體Cytb區(qū)全序列。引物為上游：5′-GAAAAACCATCGTTGTCATTCA-3′；下游5′-GGAGGTTGGTAGCTCTCCTTTT-3′[11]，擴增片段大小約1 200 bp。PCR反應體系：反應體系為25 μL，按順序分別將2×PCR buffer for KOD FX Neo 12.5 μL，2 Mm dNTPs 5 μL，10 pmol/μL上游引物 0.75 μL，10 pmol/μL下游引物0.75 μL，PCR grade water 3.5 μL，模板DNA 1.5 μL，KOD FX NEO(1.0 OU/L)1 μL。PCR反應程序為：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40個循環(huán)；反應結束后在68℃再延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物公司純化并雙向測序，測序引物為擴增引物。

2.3 個體識別

經(jīng)物種識別確定后的馬鹿糞便樣品使用多態(tài)性較高的9對微衛(wèi)星引物CSSM19、BM1818、T501、BM3628、T530、RT1、DM45、HAUT14、T156[12-16]進行基因分型分析，共篩選得到糞便DNA質量較高的297份樣本，識別出278個阿拉善馬鹿個體，并用于后續(xù)的種群遺傳多樣性研究。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Bioedit 7.0.5.3[17]對測得的序列進行排列對比并輔以人工校對，用DNASP 5.00.07[18]計算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)和單倍型多樣性(Haplotype diversity，h)，以對馬鹿種群的遺傳多樣性進行評估，用MEGA 7.0.26[19-21]和MrBayes v3.2.6[22]以梅花鹿(C.nippon)序列(登錄號：AB211429)作為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Network 5.00.3[23]以 Median-joining 法構建各單倍型之間網(wǎng)絡關系圖，并對圖中各個單倍型進行群體對應關系分析。

3 結果

本實驗成功擴增出107個阿拉善馬鹿Cytb區(qū)基因全序列，序列長1 075 bp，堿基T的平均含量為29.38%，堿基C的平均含量為26.69%，堿基A的平均含量為30.31%，堿基G的平均含量為13.62%，A+T的平均含量為59.68%，顯著高于C+G的平均含量40.32%。因此阿拉善馬鹿線粒體Cytb區(qū)富含堿基A和T并反G偏歧。說明堿基含量具有一定的偏歧性，符合哺乳動物堿基組成比例。

在獲得的1 075 bp全序列中，保守位點有1 065個，變異位點有10個，均為堿基置換無插入缺失，其中單突變位點7個，簡約變異位點3個，占分析位點的0.93%。單突變位點5、15、47、174、253、389、1 038，保守位點11、1 039、1 040。共定義了10個單倍型，其中有93個個體共享1個單倍型，6個個體共享1個單倍型，其他單倍型均為獨有的。單倍型多樣性(h=0.243)，核苷酸多樣性(π=0.000 32)。中性檢驗得到Tajima’sD值為-2.073 91(P<0.005)，F(xiàn)u and Li’sD值為-3.610 35(P<0.02)。

基于本研究的序列數(shù)據(jù)(Hap_1—Hap_10)與從 GenBank 中檢索獲得的 15條近緣馬鹿群體(Hap_11—Hap_24)的線粒體CytbDNA全序列，采用鄰接(NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)生樹(Kimura 2-parameter model)通過1 000次的自舉檢驗估計系統(tǒng)發(fā)育關系樹構建中節(jié)點(圖2)，用Modeltest 3.7分析得到最佳模型HKY+I(-lnL=2 007.419 2，AIC=4 024.838 4)，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛法(MCMC)運行100萬代，取樣頻率為100代，丟棄25%老化值(burnin samples)(圖3)。登錄號：東北馬鹿：AB021097(共享Hap_1)、AF423197(Hap_11)、GU457434(Hap_12)、JF893493(Hap_13)、KM410148(Hap_14)、JF893494(Hap_15)；天山馬鹿：HQ191429(Hap_16)、KJ025072(Hap_17)、KF781108(Hap_18)、KF781115(Hap_19)、KF781114(Hap_20)；西藏馬鹿：AY044861(Hap_21)；四川馬鹿：AY035875(Hap_22)；甘肅馬鹿：AY070223(Hap_23)、AB021098(Hap_24)。結果發(fā)現(xiàn)這24個單倍型分為明顯的2支，阿拉善馬鹿線粒體CytbDNA單倍型聚為一個單系，與東北馬鹿親緣關系較近。依據(jù) Network 軟件以中接法(Median-joining)構建的單倍型進化網(wǎng)絡關系圖顯示(圖 4)，Hap_1—Hap_10大部分單倍型之間經(jīng)過一步突變，Hap_1做為阿拉善馬鹿祖先單倍型。單倍型進化網(wǎng)絡圖進一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，阿拉善馬鹿10個單倍型與其他引用的單倍型明顯分離形成兩個類群。

圖2 使用鄰接法構建的24個單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

圖3 基于線粒體Cyt b區(qū)單倍型構建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 MrBayes phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

圖4 24個單倍型的網(wǎng)絡關系Fig.4 Network relationship of the 24 haplotypes

4 討論

本次研究采集的樣品為非損傷取樣方法采集，使用糞便樣本提取的DNA數(shù)量有限且質量較差，線粒體標記可能出現(xiàn)擴增錯誤等問題。在采樣過程中盡可能采集新鮮糞便以保證提取的DNA質量，在實驗過程中通過雙向測序和重復測序的方法，讓每個DNA樣品至少通過兩次獨立的擴增、測序來保證其測序結果的準確性。

遺傳多樣性是評估種群在野外長期生存能力的重要指標，也是制定物種保護計劃所必需的內(nèi)容之一。衡量一個種群線粒體DNA多樣性有兩個指標：單倍型多樣度值(h)和核苷酸多樣度值(π)。h值和π值越大，群體的多態(tài)性程度越高，遺傳多樣性也越豐富。通過與其他馬鹿亞種線粒體Cytb區(qū)DNA的研究相比較，發(fā)現(xiàn)阿拉善馬鹿的h值和π值都較低(表1)。表明阿拉善馬鹿的遺傳多樣性較低，分析原因可能是賀蘭山周圍被城市、沙漠、河流(黃河)隔斷形成孤島的地理特征所影響，易發(fā)生近親繁殖，缺少有效的基因交流，從而導致阿拉善馬鹿種群的遺傳多樣性降低。

在本研究的10個突變位點中無堿基插入和缺失，說明該物種的線粒體CytbDNA突變是近期發(fā)生的[26]。且在系統(tǒng)發(fā)生樹中明顯看到阿拉善馬鹿聚為一個單系，這與同域分布的賀蘭山巖羊在中國不同地理種群的系統(tǒng)發(fā)生樹結果相似[27]。中性檢驗除Fu’sFs為顯著負值外，都為不顯著的負值，表示群體可能經(jīng)歷過種群擴張。從系統(tǒng)發(fā)生樹與單倍型的網(wǎng)絡關系圖中發(fā)現(xiàn)阿拉善馬鹿與東北馬鹿親緣關系較近，與甘肅馬鹿、四川馬鹿、西藏馬鹿親緣關系較遠。

表1 多個馬鹿亞種的遺傳多樣性參數(shù)比較

Tab.1 Comparison of genetic diversity parameter of muti-subspecies of red deer

本研究證明了阿拉善馬鹿遺傳多樣性較低，且與東北馬鹿親緣關系較近，與中國分布的其他馬鹿亞種親緣關系較遠。在本研究的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖2，圖3)看到中國分布的這6個馬鹿亞種先分化成兩支，后分化出東北馬鹿、甘肅馬鹿、四川馬鹿、西藏馬鹿和阿拉善馬鹿(圖2)。進一步證明了中國馬鹿是從中東和歐洲返回大陸的過程中是從西向東逐漸分化的[4]，這為中國馬鹿的分子系統(tǒng)進化和大陸遷移史研究提供了科學依據(jù)。

致謝：感謝寧夏賀蘭山國家級自然保護區(qū)和內(nèi)蒙古賀蘭山國家級自然保護區(qū)的工作人員在樣品采集過程中給予的幫助。