[摘要] 目的 探討B(tài)ak基因在大鼠急性脊髓損傷（ASCI）中的表達(dá)及其意義。 方法 選取64只SD大鼠隨機分為模型及對照兩組，每組32只，模型組以改良Allen's法制作SD大鼠急性脊髓損傷動物模型，對照組只行椎板切開不損傷脊髓。分別于傷后3 h、1、3、7 d時（每個時間點8只）應(yīng)用改良Tarlov評分法評價其神經(jīng)功能；然后處死動物，取受損節(jié)段脊髓行HE染色及免疫組化染色，觀察形態(tài)學(xué)改變和Bak基因表達(dá)的特點；并應(yīng)用TUNEL方法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。其量的評定借助于麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)A（Motic.med 6.0）軟件，結(jié)果分別用累積光密度及細(xì)胞凋亡指數(shù)來表示。 結(jié)果 對照組大鼠下肢功能均無明顯癱瘓，模型組大鼠下肢均出現(xiàn)不同程度功能障礙，對照組各時間點的Tarlov評分均高于實驗組（P<0.05）。對照組各時間點脊髓組織未見明顯出血、水腫和細(xì)胞凋亡壞死，模型組各時間點脊髓組織均有不同程度出血、水腫、細(xì)胞凋亡及壞死。對照組未見明顯Bak基因表達(dá)，模型組各時間點Bak基因表達(dá)均明顯高于對照組（P<0.05），模型組內(nèi)Bak基因表達(dá)3 h點出現(xiàn)，1 d增加，3 d達(dá)高峰，7 d明顯減少。模型組內(nèi)細(xì)胞凋亡3 h點少量出現(xiàn)，1 d增加，3 d達(dá)高峰，7 d明顯減少。 結(jié)論 脊髓損傷激活Bak基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能為其病情進(jìn)展的重要機制之一。

[關(guān)鍵詞] 脊髓損傷；Bak基因；細(xì)胞凋亡；Bcl-2家族

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）12-26-04

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩種形態(tài)，以后者最為多見，多由急性外傷引發(fā)。隨著現(xiàn)代機械產(chǎn)業(yè)和交通運輸?shù)陌l(fā)展，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年升高，為目前全球性醫(yī)學(xué)研究熱點之一[1-2]。研究結(jié)果顯示，脊髓損傷可累及感覺、運動、反射等多項生理功能；臨床表現(xiàn)為組織水腫、缺血、細(xì)胞壞死等，其中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡為其繼

發(fā)性功能退變的主要機制。Bak基因為Bcl-2同源類似物，可介導(dǎo)Bcl-2的凋亡抑制效應(yīng)，具有促凋亡樣作用。臨床癌癥研究結(jié)果顯示[3-4]，Bal-xl/Bak表達(dá)異常，可介導(dǎo)癌細(xì)胞的增生或凋亡過程，影響患者的病情進(jìn)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸。近年研究表明，Bcl-2家族在脊髓損傷的發(fā)病過程中，發(fā)揮了重用作用，其中Bcl-2低表達(dá)為脊髓神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡的重用觸發(fā)因素之一。本研究以急性脊髓損傷大鼠模型的Bak表達(dá)情況與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系為切入點，探討B(tài)ak基因在大鼠急性脊髓損傷（ASCI）中的表達(dá)及其意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組 健康SPF級SD大鼠64只（由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），雌雄各半；月齡3～3.5個月，平均（3.2±0.6）個月；體重205～240 g，平均（221.0±17.3）g。隨機分為模型組和對照組各32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度21～25℃，濕度55%～65%。

1.1.2 主要儀器 Allen's撞擊器（采用不銹鋼自行制備）；全自動石蠟切片機（ERM4000，常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（WD841-1，吳江萬達(dá)電熱設(shè)備有限公司）；超低溫冰箱（DW-86L205，廣州傲雪制冷設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（CYG-055D，麥克奧迪）等。

1.1.3 主要試劑 青霉素注射液（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；慶大霉素注射液（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；HE染色液試劑盒（上海億欣生物有限公司）；TUNEL試劑盒（南京凱基）；Bax一抗（abcam）；Bax二抗（abcam）；其他試劑如二甲苯、蔗糖、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠脊髓損傷模型的制備方法 模型組以改良Allen's法制備脊髓損傷大鼠模型，對照組行椎板切開，不損傷脊髓。制備方法：（1）1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于解剖板；（2）以浮肋與13胸椎連接處為基準(zhǔn)點，在5 cm2范圍內(nèi)脫毛，顯露光滑皮膚組織；（3）酒精消毒，以消毒器械操作，在后正中線2～3 cm做縱行切口，依次切開皮膚、筋膜，可見白色腱膜；（4）借助剝離分針鈍性剝離椎旁肌肉叢，可暴露棘突、椎板和橫突；（5）定位并標(biāo)記T10胸椎，在椎體上下中橫向切口，再以兩個縱向切口將其連接成方形結(jié)構(gòu)，并以咬骨鉗去除該骨板，顯露方形骨窗；（6）以自制Allen's撞擊器打擊T10胸椎內(nèi)側(cè)，保持自由落體運動，控制高度約2.5～3.0 cm，每次擊打保持在打擊點停留2～3 min；（7）至脊髓組織出現(xiàn)血腫，硬脊膜呈紫紅色停止擊打，縫合傷口；（8）單籠飼養(yǎng)，青霉素聯(lián)合慶大霉素抗感染，并人工輔助排尿，保持墊料清潔，并及時清理傷口分泌物。

1.2.2 大鼠脊髓損傷模型的評價方法 本實驗以組織學(xué)病理特征和神經(jīng)功能評分作為模型評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2.1 神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法 （1）1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，行4%多聚甲醛心臟灌流，灌流前以生理鹽水沖凈循環(huán)系統(tǒng)血液，至臟器白化后方可滴注多聚甲醛；（2）取T9～T11椎體之間所有脊髓組織，浸泡于4%多聚甲醛12～24 h，以常規(guī)蔗糖梯度脫水法脫水，石蠟包埋；（3）包埋后石蠟塊可于-70℃超低溫冰箱保存，使用時以恒冷箱切片機切成15μm切片，常規(guī)HE染色，觀察組織形態(tài)。

1.2.2.2 神經(jīng)功能評定方法 按照改良Tarlov標(biāo)準(zhǔn)，見表1；采用雙盲法，由2位觀察人員打分，每只大鼠觀察5次，每次5 min，記錄總分，取平均值。

1.2.3 Bak基因表達(dá)測定方法 采取常規(guī)免疫組化染色法測定石蠟切片Bak基因表達(dá)，一抗和二抗?jié)舛确謩e為0.5%、1%，封片后熒光顯微鏡觀察，并以麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度測定。

1.2.4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)測定方法 按TUNEL試劑盒說明書操作：（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，先后經(jīng)蛋白酶K、3% H2O2、甲醇處理，小牛血清封閉；（2）混勻TUNEL反應(yīng)液，滴于玻片組織面，恒溫箱孵育，37℃，1 h；（3）熒光顯微鏡檢測，并以麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，在高倍光鏡下，選取5個視野，計算神經(jīng)細(xì)胞指數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行分析；計量資料以（）表示，行t檢驗；計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，行x2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備結(jié)果

本組大鼠共制備模型32只，2例死亡，其他大鼠均全部存活，模型制備結(jié)果如下。

2.1.1 病理切片形態(tài)學(xué)變化 病理切片顯微觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠各時間點脊髓組織均有不同程度血腫和壞死；而對照組大鼠無明顯變化。

2.1.2 神經(jīng)功能評分比較 對照組大鼠下肢功能基本處于正常狀態(tài)，而模型組表現(xiàn)出不同程度功能障礙，其Tarlov評分顯著低于對照組（P<0.01）。見表2。

2.2 Bak基因表達(dá)結(jié)果

對照組未見明顯Bak基因表達(dá)，模型組Bak基因表達(dá)于術(shù)后3 h點出現(xiàn)，1 d增加，3 d達(dá)高峰，7 d明顯減少；其各時間點Bak基因表達(dá)均明顯高于對照組（P<0.05）；見表3、圖1。

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)

對照組未見明顯神經(jīng)細(xì)胞凋亡，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡于術(shù)后3 h點出現(xiàn)，1 d增加，3 d達(dá)高峰，7 d明顯減少；其各時間點神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)表達(dá)均明顯高于對照組（P<0.01）；見表4、圖2。

3 討論

SCI可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，前者是指脊髓組織受直接機械外力作用而發(fā)生的實質(zhì)性損傷；后者則是指脊髓組織受損后的繼發(fā)性病理改變，以神經(jīng)元受損和神經(jīng)細(xì)胞凋亡為主要微觀特征，表現(xiàn)出組織水腫、微循環(huán)障礙、缺血性壞死、及繼發(fā)性炎癥等一系列病理征象。本組實驗以改良Allen's法制備脊髓損傷大鼠模型，重在研究其脊髓受創(chuàng)后的繼發(fā)性病理變化以及在這一變化中Bak基因與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性；根據(jù)本實驗研究結(jié)果，分述如下。

3.1 模型的制備

本實驗以Allen's打擊法制備大鼠脊髓損傷模型，采取自制不銹鋼Allen's撞擊器。長度大于創(chuàng)面，并以刻度標(biāo)記，方便根據(jù)軸點計算不同擊打高度的擊打力度。本組實驗選取擊打高度2～3 cm，擊打重量約為120～180 g。其基本理論依據(jù)為以一定力量撞擊脊髓，造成突發(fā)性機械力損傷；伴隨擊打次數(shù)增多，出現(xiàn)血腫、組織壞死等病理表現(xiàn)，最大限度的模仿或接近人類骨髓損傷的病理反應(yīng)態(tài)[5]。目前，相關(guān)脊髓損傷模型的研究，多以胸段脊髓為對象；根據(jù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，結(jié)合臨床實踐，本實驗選取T10胸椎體，主要基于以下考慮：（1）與臨床病例收入情況保持一致。胸段脊髓損傷為臨床患者最常見部位，因此，本實驗首要定位為胸椎。（2）從大鼠解剖結(jié)構(gòu)而言，T10部位解剖、定位操作比較簡單，相應(yīng)簡化了手術(shù)難度，可保證定位的準(zhǔn)確性及手術(shù)成功率。

模型評價結(jié)果顯示，模型組大鼠各時間點脊髓組織均有不同程度血腫和壞死；而對照組大鼠無明顯變化。對照組大鼠下肢功能基本處于正常狀態(tài)，而模型組表現(xiàn)出不同程度功能障礙，其Tarlov評分顯著低于對照組（P<0.01）。提示模型組大鼠可表現(xiàn)出脊髓損傷的典型特征，本實驗?zāi)Ｐ椭苽浠境晒Α?/p>

3.2 Bak基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

近年研究表明，SCI的最終損傷程度取決于細(xì)胞凋亡的最終狀態(tài)；而細(xì)胞凋亡為脊髓損傷后的繼發(fā)性進(jìn)展，以局部神經(jīng)生長因子缺乏、促凋亡因子激活等因素密切相關(guān)[6-7]。

Bcl-2和Bax分別為細(xì)胞凋亡抑制因子和促凋亡因子，研究表明[8]，Bcl-2在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用，抑制多種因素或因子誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮凋亡抑制作用。Bcl-2主要存在于細(xì)胞線粒體，屬于細(xì)胞凋亡的原癌基因之一，可在不影響細(xì)胞周期和分化的基礎(chǔ)上抑制細(xì)胞凋亡、延長細(xì)胞壽命[9]。其作用機制尚未完全闡明，可能與以下因素有關(guān)[10]：（1）減少氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物形成，起到抗氧化應(yīng)激性損傷樣作用；（2）抑制凋亡信號的細(xì)胞間傳導(dǎo)，防止凋亡反應(yīng)激活；（3）與其他促凋亡因子結(jié)合，抑制其活性。Bax的高表達(dá)對Bcl-2有抑制作用，從某種意義上講，Bcl-2/Bax的活性狀態(tài)最終決定了細(xì)胞的存活/凋亡狀態(tài)。作為Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的輔助分子，Bak在近年的研究中日益受到重視。

目前研究已證實，促凋亡基因Bak可介導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡反應(yīng)[11-12]。李紅等[11]研究表明Bak干擾RNA可阻斷人體顆粒細(xì)胞凋亡過程，從而起到延緩衰老的作用。陳廣生等研究表明，Bak可參與人體大多數(shù)星形細(xì)胞瘤地凋亡過程，其作用力度在高分化的星形細(xì)胞瘤中顯著高于低分化細(xì)胞。在癌癥領(lǐng)域的研究中，亦有類似報道，包括乳腺癌、肝癌、肺癌等多種組織和多個系統(tǒng)[13-14]。在脊髓損傷的研究中，已證實Bcl-2系統(tǒng)的廣泛性參與，而相關(guān)Bak的獨立研究較為鮮見，其介導(dǎo)脊髓損傷的具體機制尚未完全明確[15]。本研究分析其可能與Bak對Bax的協(xié)調(diào)作用有關(guān)，而Bax是否可以發(fā)揮單獨作用尚需深入研究。

綜上所述，脊髓損傷的過程，呈以細(xì)胞凋亡為主的進(jìn)行性進(jìn)展態(tài)。在損傷后各時段，細(xì)胞凋亡指數(shù)與Bak呈現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，即先增加后減少的典型特征。提示急性脊髓損傷激活Bak基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能為其病情進(jìn)展的重要機制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 徐委，程黎明.神經(jīng)營養(yǎng)因子修復(fù)脊髓損傷的研究與應(yīng)用[J].中國組織工程研究，2013，23（2）：369-374.

[2] 陳志斌，陳國鋒.脊髓損傷機制的研究進(jìn)展[J].中外醫(yī)療，2010，33（33）：184-186.

[3] 李海，鄧志勇，陳金珍，等.凋亡相關(guān)基因蛋白bcl-xl和bak在肺鱗癌中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（1）：70-72.

[4] 張冀松，夏敬文，陳小東.吸煙的慢性阻塞性肺病患者外周血中性粒細(xì)胞Bak mRNA的表達(dá)[J].復(fù)旦學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，37（6）：657-661.

[5] 李一帆，陳東，張大威，等.急性大鼠脊髓損傷Allen's法模型的改良及電生理評價[J].中國實驗診斷學(xué)，2010，14（8）：1169-1172.

[6] Barbara Schellenberg，Pengbo Wang，James A.Keeble，et al.Bax exists in a dynamic equilibrium between the cytosol and mitochondria to control apoptotic priming[J].Mol Cell，2013，49（5）：959-971.

[7] Dewson G，Ma S，F(xiàn)rederick P，et al.Bax dimerizes via a symmetric BH3：groove interface during apoptosis[J]. Cell Death Differ，2012，19（4）：661-670.

[8] 許維澄，林小雯，王群波，等.高濃度醫(yī)用臭氧對大鼠運動功能和脊髓Bax、Bcl-2表達(dá)的影響[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2013，19（2）：95-97.

[9] Shang H.Lin，Meenu N.Perera，Toan Nguyen，et al.Bax forms two types of channels， one of which is voltage-gated[J]. Biophys J，2011，101（9）：2163-2169.

[10] 鄧亮，吳娣，洪一江，等.BCL-2家族的研究新進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：1936-1938，2073.

[11] 李紅，曾衛(wèi)森，羅琛，等.Bax/Bak在抑制人顆粒細(xì)胞凋亡中的作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，29（12）：2367-2370.

[12] 馮樂平，喬偉，Craig Brooks.Bak在細(xì)胞凋亡期間對線粒體形態(tài)學(xué)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2008，34（5）：773-777，722.

[13] 梁芙蓉，秦建全，沈曉云.凋亡通路中Bax和Bak蛋白的激活模型[J]. 生命的化學(xué)，2011，31（6）：858-862.

[14] 賈煒，李占全，崔森，等.慢性高原病患者骨髓組織Bak和Bax蛋白的表達(dá)水平研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（18）：3071-3074.

[15] Bethann N.Johnson，Alison K.Berger，Giuseppe P.Cortese，et al.The ubiquitin E3 ligase parkin regulates the proapoptotic function of Bax[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（16）：6283-6288.

（收稿日期：2013-04-22）