[摘要] 目的 探討二至百合濃縮膏對(duì)去勢(shì)雌性大鼠（雙側(cè)卵巢切除術(shù)）焦慮行為學(xué)的影響。 方法 3～4月齡Wistar雌性大鼠隨機(jī)分成5組，假手術(shù)對(duì)照組，模型組，二至百合高、中、低劑量組。除假手術(shù)組，其余用手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢建立去勢(shì)更年期大鼠模型，給藥組分別給予二至百合濃縮膏水溶液（1.92、0.96、0.48 g/kg），假手術(shù)空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予相應(yīng)容量的蒸餾水，連續(xù)45 d。采用高架十字迷宮和明暗箱實(shí)驗(yàn)，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠行為學(xué)的變化。 結(jié)果 二至百合高劑量組可顯著減低模型大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中OT%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。二至百合高、中劑量組亦可顯著升高大鼠明箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。 結(jié)論 二至百合濃縮膏具有較好的改善去勢(shì)雌性模型大鼠焦慮癥狀的作用。

[關(guān)鍵詞] 二至百合濃縮膏；抗焦慮；雌性大鼠；去勢(shì)；高架十字迷宮；明暗箱

[中圖分類(lèi)號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）12-20-03

更年期綜合征是婦女在這一時(shí)期由于雌激素水平下降所致的以機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)、植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主，伴有神經(jīng)心理癥狀的一組癥候群。二至百合組方中包含女貞子、旱蓮草、百合、知母、牡蠣等中藥組成成分，具有滋陰潛陽(yáng)，退熱安神之功效。主要用于婦女更年期初期，證見(jiàn)陰虛陽(yáng)亢，陰虛發(fā)熱，骨蒸潮熱，焦慮煩躁，失眠多夢(mèng)者。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雌性大鼠雙側(cè)卵巢祛除術(shù)復(fù)制大鼠更年期綜合征模型，觀察二至百合方對(duì)模型大鼠焦慮行為學(xué)指標(biāo)的影響，初步評(píng)價(jià)藥物的改善更年期焦慮作用。

1 資料與方法

1.1 藥品及試劑

二至百合濃縮膏，北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司（批號(hào)20120902）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，75只，雌性，體重（200±20）g，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證編號(hào)：SCXK-（軍）2007-004。

1.3 儀器

海爾BCD-257SL冷藏冷凍冰箱：青島海爾股份有限公司；Sartorious BT 124S電子精密天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；明暗穿梭箱、高架十字迷宮、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、SLY-ETS小動(dòng)物行為活動(dòng)記錄分析系統(tǒng)，均由北京碩林苑科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型制備與分組 在適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，將75只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為：假手術(shù)空白組，模型組，二至百合高劑量（1.92 g濃縮膏/kg）、中劑量（0.96 g濃縮膏/kg）、低劑量（0.48 g濃縮膏/kg）組，每組15只。

模型組及受試樣品3個(gè)劑量組制備雌性去勢(shì)大鼠（雙側(cè)卵巢切除術(shù)）模型[1-2]：大鼠0.1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g體重（50 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉大鼠取俯臥位，在背部中1/3處剪毛、備皮，碘伏常規(guī)消毒。自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約2～3 cm，切開(kāi)皮膚，沿肩胛線分別于左右兩肋下剪開(kāi)腰肌，暴露出卵巢及緊密相連的子宮，在子宮角上做兩個(gè)結(jié)扎，結(jié)扎后切斷，將卵巢摘除，縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)腹腔注射72萬(wàn)U/kg青霉素，以防感染，1次/d，連續(xù)3 d。術(shù)后第3天開(kāi)始給大鼠陰道涂片觀察，連續(xù)5 d，每天1次，以確定卵巢完全切除。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從術(shù)后的第5天起全部進(jìn)入動(dòng)情間期，但動(dòng)物不再出現(xiàn)動(dòng)情前期，動(dòng)情期的雌激素變化，動(dòng)物基本上符合“更年期”表現(xiàn)。假手術(shù)空白組大鼠除不行卵巢摘除外，其余步驟同模型組。

造模后9 d，除假手術(shù)空白組和模型組給予等體積蒸餾水外，其余各組開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)45 d后分別進(jìn)行高架十字迷宮和明暗箱行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試（先開(kāi)展高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，其后間隔1周后開(kāi)展明暗箱實(shí)驗(yàn)）。

1.4.2 大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 末次給藥30 min后，進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)的測(cè)評(píng)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將大鼠放入高架十字迷宮中央，頭朝開(kāi)臂，觀察5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況[3-5]。觀察并記錄以下各項(xiàng)指標(biāo)：進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)，進(jìn)入閉臂次數(shù)，以及在兩臂的滯留時(shí)間。分別計(jì)算大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的時(shí)間占總時(shí)間（開(kāi)臂和閉臂滯留的時(shí)間之和）的百分比（open arm time percent，OT%），以及大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)占總次數(shù)（開(kāi)臂與閉臂之和）的百分比（open arm entry percent，OE%）。觀察時(shí)以大鼠四爪均進(jìn)入開(kāi)臂或閉臂為準(zhǔn)。

1.4.3 大鼠明暗箱實(shí)驗(yàn) 末次給藥30 min后，將大鼠置于明箱中央，背朝通道，觀察5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況并記錄明暗箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)。

以上兩種行為學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，應(yīng)保持外界環(huán)境安靜，每次放入大鼠前清理干凈箱內(nèi)的排泄物，盡可能保證每批次檢測(cè)的客觀性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊選用One-Way ANOVA法進(jìn)行各組間比較；方差不齊選用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 二至百合濃縮膏對(duì)去勢(shì)大鼠高架十字迷宮行為活動(dòng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組組大鼠與假手術(shù)空白組比較，OE%和OT%顯著減?。ň鵓<0.01），表現(xiàn)出明顯的焦慮癥狀。二至百合高劑量組可顯著減低模型大鼠OT%，與模型組組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明受試品具有較好的改善去勢(shì)雌性模型大鼠高架十字迷宮焦慮癥狀的作用。見(jiàn)表1。

2.2 二至百合濃縮膏對(duì)去勢(shì)大鼠明暗箱穿梭行為的影響

研究結(jié)果顯示，模型組大鼠明箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)均顯著降低，與假手術(shù)空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P<0.001， P<0.05），表明模型組大鼠去勢(shì)后，產(chǎn)生了明顯的焦慮行為改變。與模型組比較，二至百合高劑量組可顯著升高大鼠明箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)（分別P<0.001，P<0.01），中劑量組可顯著升高大鼠明箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)（均P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

更年期綜合征[6]屬于中醫(yī)學(xué)“絕經(jīng)前后諸癥”范疇，歷代文獻(xiàn)關(guān)于本病的論述散見(jiàn)于“臟躁”“心悸”“失眠”“眩暈”“頭痛”“郁證”等病癥中。絕經(jīng)前后腎臟虛損，腎氣漸衰，陰精耗傷，陰陽(yáng)平衡失調(diào)，臟腑功能紊亂而出現(xiàn)絕經(jīng)前后諸癥證候[7]。隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)不斷老齡化和社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈，不良的工作環(huán)境、家庭關(guān)系緊張及精神等因素影響，婦女進(jìn)入更年期逐漸增加、年齡提早，從而使更年期焦慮癥的發(fā)病率亦明顯增加[8]。因此治療和緩解更年期綜合征焦慮癥具有重要的社會(huì)意義。

二至百合方由經(jīng)典方劑“二至丸”和“百合知母湯”合方加減而成，具有滋陰潛陽(yáng)，退熱安神之功效。本研究主要通過(guò)雌性大鼠卵巢祛除術(shù)復(fù)制大鼠更年期綜合征模型，進(jìn)而采用高架十字迷宮和明暗箱實(shí)驗(yàn)觀察二至百合方對(duì)模型大鼠焦慮行為學(xué)的影響，評(píng)價(jià)處方的改善更年期綜合征焦慮作用。

高架十字迷宮模型，為抗焦慮研究中公認(rèn)的非條件反射模型，是抗焦慮研究中應(yīng)用最廣泛的模型之一[9]。它利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性相對(duì)高懸敞開(kāi)臂的恐懼心理，形成動(dòng)物的矛盾行為，進(jìn)入開(kāi)放臂的百分?jǐn)?shù)（OE%）和在開(kāi)放臂停留時(shí)間的百分?jǐn)?shù)（OT%）反映的是動(dòng)物趨近規(guī)避沖突的結(jié)果，與焦慮程度直接相關(guān)。通?？菇箲]藥只增加動(dòng)物對(duì)開(kāi)放臂的探索，使OE%和OT%上升。開(kāi)放臂和封閉臂總進(jìn)入次數(shù)反映了動(dòng)物總的運(yùn)動(dòng)能力，可用來(lái)觀察藥物有無(wú)鎮(zhèn)靜作用及鎮(zhèn)靜強(qiáng)度。被保護(hù)區(qū)的活動(dòng)性一定程度上與抗焦慮劑的效應(yīng)相關(guān)[10]焦慮動(dòng)物的OE%和OT%明顯降低，經(jīng)典抗焦慮藥物則使兩者升高[11]；明暗箱行為實(shí)驗(yàn)[12-13]中，明箱活動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，探洞和穿梭次數(shù)越多，反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索欲望水平越高，探索欲越強(qiáng)則代表環(huán)境適應(yīng)能力越強(qiáng)，焦慮水平越低。

本實(shí)驗(yàn)以去勢(shì)大鼠造成更年期模型，考慮動(dòng)物行為檢測(cè)的個(gè)體差異可能比較大，所以本實(shí)驗(yàn)選用了較為經(jīng)典的2種焦慮行為檢測(cè)方法進(jìn)行二至百合膠囊的抗焦慮實(shí)驗(yàn)。本研究表明，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)空白組比較，去勢(shì)大鼠進(jìn)入開(kāi)閉時(shí)間和次數(shù)的百分率顯著下降，在明暗箱實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)空白對(duì)照組比較，去勢(shì)大鼠在明箱停留時(shí)間明顯縮短，穿箱次數(shù)明顯減少。由此提示，去勢(shì)動(dòng)物處于焦慮狀態(tài)。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，二至百合濃縮膏3個(gè)劑量組均可增加去勢(shì)大鼠OE%和OT%值，與模型組比較，中劑量組OE%和OT%值有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量組的OT%值與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量組的OE%和OT%值與模型組比較有增加，但無(wú)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二至百合濃縮膏有一定的抗焦慮作用。明暗箱實(shí)驗(yàn)中，二至百合濃縮膏高、中劑量組大鼠的明箱停留時(shí)間和穿箱次數(shù)與模型組大鼠相比均顯著增加（P<0.05或P<0.01）。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二至百合濃縮膏在大鼠高架十字迷宮和明暗箱行為學(xué)測(cè)試中均表現(xiàn)出較好的抗焦慮作用，表明受試品具有較好的改善去勢(shì)雌性模型大鼠焦慮癥狀的效應(yīng)。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道含有百合[14-15]、知母[16-17]等藥物組方在臨床上對(duì)更年期綜合征具有明顯治療作用，有實(shí)驗(yàn)表明含有女貞子[18]的復(fù)方藥物連續(xù)灌胃可明顯降低更年期大鼠血清促性腺激素FSH含量，對(duì)血清E2含量有顯著增加作用，使更年期陰虛內(nèi)熱、煩躁不安、失眠等癥狀得以緩解。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明二至百合方對(duì)更年期焦慮癥狀有明顯改善，對(duì)更年期綜合征有一定的緩解作用，但是二至百合方改善更年期綜合征模型大鼠焦慮行為學(xué)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，199：1293

[2] 董麗，程衛(wèi)東，李建，等.玫參膠囊對(duì)雌性去卵巢大鼠性激素與下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30（3）：356-357.

[3] 王欣，謝鳴.酸棗仁湯對(duì)高架十字迷宮大鼠行為學(xué)影響的量效關(guān)系評(píng)價(jià)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2004，10（1）：35.

[4] Pellow S，Chopin P，F(xiàn)ile SE，et al.Validation ofopen：closed arm entries in an elevated plus-maze as ameasureof anxiety in the rat[J].J Neurosci Methods，1985，14（3）：149-167.

[5] Bertoglio LJ，Carobrez AP.Previousmaze experience required to increase open arms avoidance in rats submitted to the elevated plus-maze model of anxiety[J].Behav Brain Res，2000，108（2）：197-203.

[6] 樂(lè)杰，謝幸，豐有吉.婦產(chǎn)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：349-352.

[7] 馬寶璋，劉瑞芬，杜慧蘭.中醫(yī)婦科學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2007：118-120.

[8] 秦莉花，李晟，易霞，等.中醫(yī)藥治療更年期焦慮癥的思考[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2012，14（11）：128-130.

[9] Gard PR，Haigh SJ，Cambursano PT，et al.Strain differences in anxiolytic effects of losartan in the mouse[J].Pharmacol Biochem Behav，2001，69：35-40.

[10] Cole JC，Rodgers RJ.An ethological analysis of the effects of chlordiazepoxide and bretazenil（Ro16-6028） in themurine ele-vated plus-maze[J].Behav Pharmaco，1993，4（6）：573-580.

[11] Dalvi A，Rodgers RJ.Behavioral effects of diazepam in the murine plus-maze：flumazenil antagonism of enhanced head dipping but not the disinhibition of open-arm avoidance[J].Pharmacol Bichem Behav，1999，62（4）：727-734.

[12] 黃繼忠，王祖承.焦慮動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)方法和藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J].上海精神醫(yī)學(xué)，2003，15（2）：106-109.

[13] 元曉麗，林文娟.焦慮和抑郁動(dòng)物模型的研究方法和策略[J].心理科學(xué)進(jìn)展，2005，13（3）：327-333.

[14] 唐安全.百合龍牡湯治療更年期綜合征50例療效觀察[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011，5（2）：184.

[15] 張士金.百合地黃湯加味聯(lián)合西藥用于更年期郁證的臨床研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，8（27）：1049-1050.

[16] 楊艷秋，周麗雅.補(bǔ)腎養(yǎng)血法治療更年期綜合征48例臨床觀察[J].吉林正醫(yī)藥，2012，32（6）：604-605.

[17] 呂新建.滋腎疏肝寧心湯治療圍絕經(jīng)期綜合征65例[J].陜西中醫(yī)，2010，31（9）：1185-1186.

[18] 周軍，甘柏柳，韋桂寧，等.安更方對(duì)更年期大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥，2009，31（9）：1331-1333.

（收稿日期：2013-04-28）