[摘要] 目的 檢測(cè)TRAIL、c-FLIP在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，探討二者在大腸腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及凋亡調(diào)控機(jī)制的可能相互關(guān)系和作用。 方法 選取新鮮結(jié)直腸癌、配對(duì)的癌旁正常組織各85例及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)51例，運(yùn)用MaxVision免疫組化和Western blot蛋白定量檢測(cè)TRAIL、c-FLIP在各組間的表達(dá)，所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 （1）TRAIL在結(jié)直腸癌組織中的定位及表達(dá)位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，而c-FLIP主要位于細(xì)胞漿。（2）TRAIL在癌組、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（LNM）組與癌旁正常組的均廣泛表達(dá)，三者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；癌組中，未/低分化陽(yáng)性表達(dá)與中高分化比較、無(wú)LNM組與LNM組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；（3）c-FLIP在癌組陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常組（且無(wú)一例強(qiáng)染色）；轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組陽(yáng)性表達(dá)亦明顯高于正常組，其強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)88.2%（45/51），與癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其癌組中未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性表達(dá)88.2%（30/34）、淋巴轉(zhuǎn)移100%（51/51）、未/低分化和中高分化分別為96.8%（30/31）、94.4%（51/54），81例陽(yáng)性表達(dá)中強(qiáng)陽(yáng)性74%（60/81）；未/低分化腺癌與中高分化組表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（4）Western blot蛋白定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于TRAIL，呈現(xiàn)出c-FLIP蛋白表達(dá)越高，其表達(dá)也反應(yīng)性增高的趨勢(shì)，TRAIL蛋白的表達(dá)與c-FLIP的表達(dá)呈相互拮抗性正相關(guān)。 結(jié)論 （1）c-FLIP在結(jié)直腸癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中存在過(guò)高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，而TRAIL在癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織也存在相互拮抗性增高趨勢(shì)。（2）高表達(dá)的c-FLIP可能與TRAIL死亡受體凋亡途徑相互作用，對(duì)大腸癌的發(fā)生進(jìn)展起到一定的作用。

[關(guān)鍵詞] TRAIL；c-FLIP；凋亡；結(jié)直腸癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

[中圖分類號(hào)] R735.3+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）12-10-04

結(jié)直腸癌是全世界臨床上最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)，其術(shù)后浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，預(yù)后極差，5年生存率低[1-2]。結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展需要眾多分子機(jī)制的參與，結(jié)直腸細(xì)胞的不穩(wěn)定性、異常延長(zhǎng)存活時(shí)間和最終惡變，與細(xì)胞凋亡機(jī)制密切相關(guān)。

TRAIL（TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體），是TNF家族成員之一，可強(qiáng)烈選擇性誘導(dǎo)和促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯促凋亡作用，是很有前景的抗腫瘤因子之一。c-Flip全稱為細(xì)胞型Fas相關(guān)的死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白，可強(qiáng)效抑制TRAIL-Rs和TNF-R1等死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而阻斷細(xì)胞發(fā)生凋亡[3-4]。目前有關(guān)于TRAIL和c-FLIP在結(jié)直腸癌中相互作用的研究鮮有報(bào)道，本研究采用免疫組化方法和Western blot對(duì)兩者在結(jié)直腸癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，以初步探討兩者在結(jié)直腸癌中相互關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集汕大附一醫(yī)院2010～2011年手術(shù)切除大腸腺癌標(biāo)本85例，配對(duì)選取距癌5 cm外正常組織相同例數(shù)，所得標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診。其中男49例，女36例，年齡21～92歲，所有患者術(shù)前未行任何治療。85例大腸腺癌中，51例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，未/低分化腺癌31例，中高分化腺癌54例。所有標(biāo)本分為兩部分，一份立即置于-80℃冰箱保存，標(biāo)本收集后進(jìn)行Western blot檢測(cè)；另一份制成常規(guī)病理標(biāo)本。

1.2 方法

免疫組化：采用MaxVision-（TM）即用型快捷免疫組化一步法，兔抗人TRAIL多克隆IgG抗體、兔抗人c-FLIP多克隆IgG抗體和免疫組織化學(xué)染色試劑盒均購(gòu)于上海博奧深生物技術(shù)有限公司；一抗TRAIL以1︰100、c-FLIP以1︰120稀釋，均以已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，DAB（聚合物法）顯色。

Western blot：Western blot相關(guān)試劑、ECL顯影液購(gòu)于上海博奧深公司，內(nèi)參β-actin及相應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)Santa公司。一抗TRAIL以1︰120、c-FLIP以1︰150稀釋，ECL顯色拍片。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色切片采用電子光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，由兩名專業(yè)病理醫(yī)師讀片，TRAIL主要表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，c-Flip主要定位于細(xì)胞質(zhì)。判斷標(biāo)準(zhǔn)均使用FDA推薦的Hercept Test6評(píng)分方法：（-）為無(wú)細(xì)胞染色或<30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜或質(zhì)較弱染色；（+）為≥30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜或質(zhì)部分較弱染色；（++）為≥30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜或質(zhì)完全較弱到中等染色；（+++）為≥30%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜或質(zhì)完全強(qiáng)染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL和c-FLIP在結(jié)直腸癌組織中的定位及表達(dá)

TRAIL在結(jié)直腸癌組織中的定位及表達(dá)位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，而c-FLIP主要位于細(xì)胞漿。見(jiàn)圖1、2，表1。

2.2 Western blot檢測(cè)TRAIL、c-FLIP蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)

在85例大腸癌組織中，免疫組化實(shí)驗(yàn)提示，在正常組織中，TRAIL存在廣泛表達(dá)，TRAIL在癌組表達(dá)78.9%（67/85）、轉(zhuǎn)移淋巴組陽(yáng)性表達(dá)74.5%（38/51）與正常組表達(dá)65%（55/85）比較，三者均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；癌組中，未/低分化陽(yáng)性表達(dá)71%（22/31）與中高分化64.8%（35/54）比較、無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移70.6%（24/34）與淋巴轉(zhuǎn)移64.7%

（33/51）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；蛋白OD值檢測(cè)TRAIL在癌組、LNM組表達(dá)量分別為1.455、1.413，較正常組（0.709）增高，且分化程度越低，TRAIL蛋白定量越高。免疫檢測(cè)在正常組織中，c-FLIP基本不表達(dá)或低表達(dá)。c-FLIP在癌組陽(yáng)性表達(dá)95.3%（81/85）明顯高于正常組（15.3%（13/85）且無(wú)一例強(qiáng)染色）；其癌組中未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性表達(dá)88.2%（30/34）、淋巴轉(zhuǎn)移100%（51/51）、低分化和高中高分化分別為96.8%（30/31）、94.4%（51/54），81例陽(yáng)性表達(dá)中強(qiáng)陽(yáng)性74%（60/81）；LNM組陽(yáng)性表達(dá)100%（51/51）亦明顯高于正常組，其強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)88.2%（45/51），與癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Western blot檢測(cè)c-FLIP蛋白OD值提示c-FLIP蛋白在癌組（2.176）與LNM組（2.089）均存在過(guò)表達(dá)，均顯著高于正常組（0.339），未/低分化腺癌較中高分化組表達(dá)更高，但癌組與淋巴結(jié)組表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3、4。

2.3 TRAIL和c-FLIP表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

TRAIL、c-FLIP的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、浸潤(rùn)層次均無(wú)相關(guān)性，但兩者的表達(dá)與淋巴結(jié)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、分化程度及臨床TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

細(xì)胞凋亡是所有多細(xì)胞生物常見(jiàn)的程序化死亡過(guò)程，是多細(xì)胞生物的生存發(fā)育和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必須的。不少研究認(rèn)為，凋亡系統(tǒng)在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移扮演重要角色，TRAIL死亡受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（即外源性凋亡途徑），與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。TRAIL能與相關(guān)受體TRAIL-Rs（DR4/TRAIL-R1、DR5/TRAIL-R2）結(jié)合以誘導(dǎo)激活凋亡信號(hào)殺死腫瘤細(xì)胞，TRAIL能特異性地作用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，而對(duì)正常組織細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用[8]。其凋亡機(jī)制可能為：TRAIL與腫瘤細(xì)胞膜上死亡受體DR4、DR5結(jié)合，受體內(nèi)死亡域DD與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域FADD結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物DISC，DISC招募下游procaspase-8，10與之結(jié)合后激活caspase-8，進(jìn)而激發(fā)caspases發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡[9-12]。正常細(xì)胞對(duì)TRAIL凋亡機(jī)制不敏感，其主要原因是正常細(xì)胞通過(guò)NF-κB介導(dǎo)、誘騙受體及c-FLIP調(diào)節(jié)來(lái)逃逸TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。TRAIL作為一種具有明顯促腫瘤細(xì)胞凋亡活性的選擇性對(duì)抗腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，可見(jiàn)其抗腫瘤作用也具有重要意義[13-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TRAIL蛋白水平在腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)較正常組織增高，且分化越低表達(dá)量更高，提示可能緣于腫瘤刺激，TRAIL反應(yīng)性表達(dá)增高，以增強(qiáng)TRAIL介導(dǎo)死亡受體凋亡系統(tǒng)在結(jié)直腸腺癌的殺傷作用。

然而，目前眾多體內(nèi)及體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，不少類型腫瘤對(duì)TRAIL介導(dǎo)的凋亡途徑均存在不同程度的抵抗，這主要與該通路下游的c-FLIP的調(diào)亡抑制作用密切相關(guān)。有研究認(rèn)為，c-FLIP在黑素瘤、胃癌、霍奇金淋巴瘤等多種人類腫瘤中均呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，而對(duì)應(yīng)的正常組織或良性病變中c-FLIP不表達(dá)或低表達(dá)，高表達(dá)的c-FLIP抑制caspase-8激活從而抑制凋亡，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡抵抗[8-10]。故提示：作為抑制凋亡因子c-FLIP，其過(guò)表達(dá)可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腺癌細(xì)胞的DISC，抑制caspase-8的活化，阻斷TRAIL介導(dǎo)的死亡受體凋亡途徑，導(dǎo)致正常細(xì)胞腫瘤化和腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展，從而起促腫瘤進(jìn)展作用。本實(shí)驗(yàn)中c-FLIP在正常結(jié)直腸細(xì)胞少量/不表達(dá)，而在結(jié)直腸腺癌顯著過(guò)表達(dá)，提示在結(jié)直腸腺癌中c-FLIP亦存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，與上訴研究結(jié)果一致。在85例大腸癌中，c-FLIP在結(jié)直腸癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中存在過(guò)高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，而TRAIL在癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織也存在相互拮抗性增高趨勢(shì)。未/低分化腺癌細(xì)胞c-FLIP表達(dá)較中高分化更高，提示其與腫瘤分期，分化密切相關(guān)，c-FLIP的過(guò)表達(dá)表明分期越晚，預(yù)后越差。

另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)c-FLIP在腺癌與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)兩者無(wú)明顯差異，故尚未能明確提示其參與腫瘤轉(zhuǎn)移免疫逃避和腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制中有促進(jìn)作用。c-FLIP在大腸癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中存在顯著高表達(dá)，能否促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，目前還沒(méi)有得到證實(shí)，且目前缺少相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)檢測(cè)TRAIL和c-FLIP蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況來(lái)推測(cè)其可能相互作用關(guān)系，并判斷是否與預(yù)后有關(guān)。在85例大腸癌中，c-FLIP在結(jié)直腸癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中存在過(guò)高表達(dá)，在正常組織低表達(dá)或不表達(dá)，而TRAIL在癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織也存在相互拮抗性增高趨勢(shì)。高表達(dá)的c-FLIP可能與TRAIL死亡受體凋亡途徑相互作用，對(duì)大腸癌的發(fā)生進(jìn)展起到一定的作用。表明c-FLIP可能能夠預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后，可能成為結(jié)直腸癌預(yù)后參照重要指標(biāo)之一。同時(shí)c-FLIP和TRAIL也可作為新的潛在治療靶點(diǎn)，進(jìn)而有效降低腫瘤生物學(xué)惡性程度，提高患者生活質(zhì)量及提高5年生存率，具有臨床前景，但需進(jìn)一步研究，為臨床相關(guān)靶點(diǎn)治療提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Assicot M.High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection[J].The Lancet，1993，341（6）：515-518.

[2] Vicari AP，Caux C.Chemokines in cancer[J].Cytokine Growth Factor Reviews，2002，13（11）：143-154.

[3] Bagnoli M，Canevari S，Mezzanzanica D.Cellular FLICE-inhibitory protein （c-FLIP） signalling：a key regulator of receptor-mediated apoptosis in physiologic context and in cancer[J].International Journal of Biochemistry Cell Biology，2010，42（3）：210-213.

[4] Adams C. Structural and functional analysis of the interaction between the agonistic monoclonal antibody Apomab and the proapoptotic receptor DR5[J].Cell Death Differentiation，2008，15（1）：751-761.

[5] Mac Farlane M. TRAIL-induced signalling and apoptosis[J].Toxicology ietters，2003，139（4）：89-97.

[6] Thomas LR.， Henson A， Reed JC， et al. Direct binding of Fas-associated death domain （FADD） to the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor DR5 is regulated by the death effector domain of FADD[J].Journal of Biological Chemistry，2004，279（6）：32780-32785.

[7] Kischkel F. C. ApoL/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5[J].Immunity，2000，12（7）：611.

[8] Bullani R. R. Selective expression of FLIP in malignant melanocytic skin lesions[J].Journal of Investigative Dermatology，2001，117（4）：360-364 .

[9] Zhou X. D. Overexpression of cellular FLICE-inhibitory protein （FLIP） in gastric adenocarcinoma[J].Clinical Science，2004，106（5）：397-406.

[10] Thomas R.K. Constitutive expression of c-FLIP in Hodgkin and Reed-Sternberg cells[J].The American Journal of Pathology，2002，160（3）：1521-1528.

[11] Bagnoli M，Canevari S，Mezzanzanica D.Cellular FLICE-inhibitory protein （c-FLIP） signalling： A key regulator of receptor-mediated apoptosis in physiologic context and in cancer[J].The International Journal of Biochemistry Cell Biology，2010，42（2）：210-213.

[12] 錢路.原癌基因HER2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2005，12（3）：228-231.

[13] 柳海，李秀，吳強(qiáng)，等.口腔鱗狀細(xì)胞癌中MMP-9、CD44v6表達(dá)及其意義[J].中國(guó)腫瘤，2005，14（11）：747-750.

[14] 戴小平，舒國(guó)順.結(jié)直腸癌EMMPRIN、MMP1、和MMP9表達(dá)及臨床病理意義[J].臨床醫(yī)學(xué)研究，2003，30（12）：889-891.

[15] 王俊萍，于雁.MMP-9與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2007，21（5）：471-474.

（收稿日期：2013-04-12）