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        五色梅葉內(nèi)生真菌YJ—11的分離鑒定及其抑菌活性

        2013-12-31 00:00:00盧衛(wèi)紅冼瓊珍朱峰
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年24期

        摘要:從廣東藥用植物五色梅(Lantana camara L.)葉片中分離到一株內(nèi)生真菌YJ-11,通過顯微形態(tài)特征觀察鑒定屬于青霉屬(Penicillium sp.)。液態(tài)靜置培養(yǎng)后,進(jìn)行有效成分提取,獲得其菌絲體甲醇提取物和發(fā)酵培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,兩種提取物對供試細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)均具顯著抑菌活性。

        關(guān)鍵詞:五色梅(Lantana camara L.)葉片;內(nèi)生真菌;青霉屬(Penicillium sp.);抑菌活性

        中圖分類號:Q939.96;R93 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2013)24-6048-03

        自從1929年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來,微生物活性代謝產(chǎn)物成為藥物的豐富源泉,現(xiàn)代幾乎所有臨床應(yīng)用的抗生素都來源于微生物。近年隨著新病原菌和新病毒的不斷出現(xiàn),癌癥和心血管病的不斷增加,特別是隨著藥物的濫用,導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生了抗藥性,人們迫切需要尋找到新的療效顯著而毒副作用小的天然藥物。植物內(nèi)生菌[1]生活在植物組織內(nèi)部,與宿主協(xié)同進(jìn)化,二者形成了互惠關(guān)系,一方面植物為內(nèi)生菌提供光合作用產(chǎn)物和礦物質(zhì),另一方面內(nèi)生菌的代謝物能刺激宿主植物的生長發(fā)育,增強(qiáng)宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。內(nèi)生菌不僅能夠參與植物次生代謝物的合成或?qū)χ参锎紊x物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,而且還能夠獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物。Stierle等[2]報道從太平洋短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中分離到的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae能產(chǎn)生抗癌活性物質(zhì)紫杉醇。Strobel等[3]發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌Gliocladium roseum(NRRL 50072)可以產(chǎn)生生物柴油。植物內(nèi)生菌已引起研究者們的極大興趣[4-7],并寄希望于從中發(fā)現(xiàn)具有特殊功能、療效顯著、毒副作用小的新穎藥物先導(dǎo)物。

        五色梅(Lantana camara L.)[8]又名馬纓丹,為馬鞭草科(Verbenaceae)馬纓丹屬(Lantana)植物,原產(chǎn)美洲熱帶,中國南北都有引種栽培,以廣東、福建、臺灣、浙江、云南、四川等地為多,華南地區(qū)的荒郊野外多有大量分布。其根、莖、葉、花可作中藥用,具有清熱解毒、散結(jié)止痛、祛風(fēng)止癢之功效;葉煎湯洗治濕疹、疥癩毒瘡、皮炎、皮膚瘙癢、臃腫,搗爛敷患處能治跌打筋傷。研究表明,五色梅提取物具有抗菌、抗病毒、消炎、抗腫瘤等生物活性,其主要有效化學(xué)成分為三萜類和黃酮類化合物[9-11],但鮮有關(guān)于五色梅內(nèi)生菌研究的報道。本研究在對五色梅植物化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上[12-14],對五色梅內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離,通過顯微鏡形態(tài)特征觀察鑒定并篩選到一株內(nèi)生真菌YJ-11,研究了其粗提物的抑菌活性,為進(jìn)一步研究開發(fā)該菌奠定了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 植物材料 五色梅枝條,2011年10月采自佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院校區(qū),采后10 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

        1.1.2 供試病原菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureu),由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。

        1.1.3 培養(yǎng)基 抗生素PDA培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的分離純化,其組成為PDA培養(yǎng)基(國產(chǎn)BR級)40 g、鏈霉素200 mg和水1 000 mL,用NaOH調(diào)pH至7。GYP培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng),其組成為葡萄糖10 g, 蛋白胨2 g,酵母浸膏1 g,水1 000 mL,用NaOH調(diào)pH至7。LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌液體培養(yǎng),其組成為胰蛋白胨10 g 、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g,水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH至7.4。肉湯瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌固體培養(yǎng),其組成為營養(yǎng)瓊脂(普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基)4 g,水100 mL。

        1.2 方法

        1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 取五色梅葉用清水洗凈, 70%乙醇溶液沖洗30 s,無菌水沖洗2次,置于0.2%氯化汞溶液中浸泡30 min,無菌水沖洗6次,無菌濾紙吸干水。在無菌條件下將五色梅葉剪成小片,置于抗生素PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 3~7 d,待真菌從組織塊邊緣長出后,挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。反復(fù)轉(zhuǎn)接純化直到菌落形態(tài)一致,得到純培養(yǎng)菌株YJ-11。PDA試管斜面接種、液體石蠟封存、 4 ℃冰箱保存。

        1.2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)觀察與鑒定 從純化培養(yǎng)數(shù)日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成玻片,置于光學(xué)顯微鏡下觀察,對照資料[15]確定真菌的分類學(xué)地位。

        1.2.3 內(nèi)生真菌的液態(tài)培養(yǎng) 1 000 mL三角瓶每瓶裝400 mL GYP培養(yǎng)基,1.25×105 Pa高壓滅菌30 min,冷卻至室溫備用。從試管斜面挑取菌絲到PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3~7 d,將活化后的菌絲接種到三角瓶中, 30 ℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)14 d。

        1.2.4 內(nèi)生真菌粗提物的制備 液體培養(yǎng)完成后,取發(fā)酵產(chǎn)物用紗布過濾,得菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)液。菌絲體風(fēng)干后用甲醇浸泡提取3次,每次24 h,合并甲醇提取液,50 ℃以下減壓回收甲醇,得到菌絲體甲醇提取物A;發(fā)酵培養(yǎng)液用乙酸乙酯等體積萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,50 ℃以下減壓回收乙酸乙酯,得到培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物B。

        1.2.5 內(nèi)生真菌提取物體外抑菌活性測定 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法[16]測定內(nèi)生真菌YJ-11粗提物對金黃色葡萄球菌的抑制作用。將提取物A和提取物B分別溶于二甲基亞砜中,配成濃度為50 mg/mL的藥液備用。測定粗提物抑菌活性步驟如下:①制作金黃色葡萄球菌菌懸液。將金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養(yǎng)基,室溫下靜置培養(yǎng)24 h,得菌懸液。②測定粗提物抑菌活性。在無菌條件下將金黃色葡萄球菌菌懸液均勻涂布于肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上,將直徑6 mm無菌藥敏紙片貼于平板上,其中2片藥敏紙片上分別加入100 μL含提取物A和B的二甲基亞砜藥液。試驗(yàn)設(shè)陰性對照(僅加二甲基亞砜),陽性對照(加鏈霉素),3個重復(fù)。于35 ℃孵育24 h,測定抑菌圈直徑。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 內(nèi)生真菌YJ-11的分離鑒定

        通過分離培養(yǎng)得到一株純的內(nèi)生真菌YJ-11(圖1),其菌落呈淡藍(lán)色,氣生菌絲為松絮狀,分生孢子梗光滑,具橫隔,頂端生有掃帚狀分枝,初步鑒定為絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Hyphomycetales)青霉屬(Penicillium sp.)。

        2.2 內(nèi)生真菌YJ-11體外抑菌活性

        紙片瓊脂擴(kuò)散法測定結(jié)果表明,藥敏紙片含5 mg提取物A和提取物B時,其周圍產(chǎn)生明顯的抑菌圈,抑菌圈直徑分別為(38.5±3.3) mm和(15.0±5.0) mm。根據(jù)紙片擴(kuò)散法抑菌結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[17],確定內(nèi)生真菌YJ-11菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)液提取物對受試細(xì)菌金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性。該菌值得進(jìn)一步研究開發(fā)。

        3 結(jié)論

        從廣東藥用植物五色梅葉中分離得到一株內(nèi)生真菌YJ-11,鑒定屬青霉屬,體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,該內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物和發(fā)酵培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物均能有效地抑制金黃色葡萄球菌。

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