摘要：篩選小球藻（Chlorella sp.）的適宜碳源，比較研究小球藻在不同營(yíng)養(yǎng)方式下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，葡萄糖能顯著促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)，且小球藻可利用葡萄糖在化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)及兼養(yǎng)條件下均可生長(zhǎng)，其比生長(zhǎng)速率從大到小依次為：兼養(yǎng)、光異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、化能異養(yǎng)及光合自養(yǎng)。兼養(yǎng)培養(yǎng)比生長(zhǎng)速率接近于光合自養(yǎng)和光異養(yǎng)培養(yǎng)下的比生長(zhǎng)速率之和。

關(guān)鍵詞：小球藻（Chlorella sp.）；微藻；適宜碳源；異養(yǎng)；兼養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S968；Q949.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）24-6030-04

隨著化石燃料的日益枯竭，現(xiàn)代社會(huì)依靠化石燃料的現(xiàn)狀遭到了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[1]。依照人類對(duì)化石燃料的消耗速率和現(xiàn)已探明的地球化石燃料儲(chǔ)量，化石燃料可能在未來(lái)50年消耗殆盡。因此，探尋可再生能源已迫在眉睫。生物柴油被認(rèn)為是最有望代替化石燃料的可再生能源[2，3]。由于傳統(tǒng)的植物油和動(dòng)物脂肪的短缺，不能滿足生物柴油生產(chǎn)的原料供給[4]，微藻以其高生長(zhǎng)速率、高油脂產(chǎn)率和生長(zhǎng)空間廣闊等優(yōu)勢(shì)被認(rèn)為是最具潛力的生物柴油原料[5]。然而在微藻自養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油的過(guò)程中也遇到了瓶頸問(wèn)題。微藻在光合自養(yǎng)（Photoautotrophy）條件下生長(zhǎng)速度緩慢，藻液濃度低，增加了微藻采收的成本[6]，使微藻制生物柴油用于商業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性很低[7]。解決這一問(wèn)題的方法之一是在自養(yǎng)培養(yǎng)基中添加外加碳源，使微藻利用外加碳源進(jìn)行異養(yǎng)（Heterotrophy）或兼養(yǎng)（Mixotrophy）生長(zhǎng)。

與高等植物相比，微藻不僅可以利用光能和CO2進(jìn)行光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，而且可以利用外加碳源進(jìn)行異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長(zhǎng)。光合自養(yǎng)的光抑制性是限制微藻生物量增加的主要原因，異養(yǎng)培養(yǎng)以外加碳為碳源和能源[8]，能夠降低光合自養(yǎng)培養(yǎng)的不足。Zheng等[9]通過(guò)異養(yǎng)培養(yǎng)Chlorella sorokiniana所得微藻細(xì)胞濃度是自養(yǎng)培養(yǎng)的3.3倍。異養(yǎng)培養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)不僅能提高微藻的生物量，還可以改變其油脂含量[10]，繆曉玲等[11]通過(guò)異養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞工程技術(shù)獲得了油脂含量高達(dá)57.9%的異養(yǎng)小球藻，使油脂含量在光合自養(yǎng)的基礎(chǔ)上提高了4倍。

小球藻（Chlorella sp.）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是一種球形單細(xì)胞淡水微藻。目前，用于產(chǎn)油制生物柴油的小球藻主要有原始小球藻（Chlorella protothecoides）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等，關(guān)于小球藻培養(yǎng)的研究報(bào)道主要集中在自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)方面[12-14]，但對(duì)小球藻的自養(yǎng)、化能異養(yǎng)（Chemoheterotrophy）、光激活異養(yǎng) （Light-activated heterotrophic growth，LAHG）、光異養(yǎng)（Photoheterotrophy）和兼養(yǎng)培養(yǎng)的系統(tǒng)比較研究報(bào)道較少。本研究對(duì)小球藻適宜碳源和其營(yíng)養(yǎng)方式進(jìn)行了比較試驗(yàn)，以期得到高密度培養(yǎng)小球藻的適宜培養(yǎng)方式，為微藻煉制生物質(zhì)燃料以及充分利用這一資源的其他領(lǐng)域提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

小球藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

SE基礎(chǔ)培養(yǎng)液（1 L）： NaNO3 250 mg， K2HPO4 75 mg， MgSO4·7H2O 75 mg， CaCl2·2H2O 25 mg， KH2PO4 175 mg， NaCl 25 mg， FeCl3·6H2O 5 mg， EDTA-Fe 1 mL， Trace mental solution 1 mL， 土壤提取液 40 mL， 蒸餾水958 mL。

試劑： 葡萄糖，丙酮酸鈉，乙酸鈉，碳酸氫鈉，碳酸鈉，3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU，購(gòu)于Sigma公司），頭孢噻肟鈉。

1.3 培養(yǎng)條件

將配制分裝好的培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，滅菌后冷卻至室溫，添加頭孢噻肟鈉至0.5 g/L防止染菌。在超凈臺(tái)中將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的微藻接種于含150 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中（接種量20% V/V）于溫度30 ℃、平均光照度5 000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗比12 h∶12 h。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 小球藻適宜碳源選擇 選取葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉作為小球藻的外加碳源，外加碳源濃度為0.1 g/L（按碳含量計(jì)，本試驗(yàn)所添加的碳源濃度均以碳含量計(jì)。下同），每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)。每隔24 h測(cè)定其生物量。

1.4.2 小球藻培養(yǎng)方式選擇 光合自養(yǎng)培養(yǎng)：將微藻接種于SE基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每隔24 h測(cè)定其生物量。

兼養(yǎng)培養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，于光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每隔24 h測(cè)定其生物量。

化能異養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，將錐形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每隔24 h測(cè)定其生物量。

光激活異養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，將錐形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗條件下培養(yǎng)，每24 h取下布袋，以5 000 lx脈沖式短波照射10 min。設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每隔24 h測(cè)定其生物量。

光異養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，并添加10-6 mol/L 3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU），于光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每隔24 h測(cè)定其生物量。

1.5 分析方法

式中μ為比生長(zhǎng)速率（d-1），N1和N0分別為T1時(shí)刻和T0時(shí)刻時(shí)小球藻的細(xì)胞密度。

微藻干重測(cè)定：培養(yǎng)至10 d后，取100 mL藻液于8 000 r/min離心5 min，用蒸餾水洗2次，置于已恒重的稱量瓶中，105 ℃下烘干至恒重，用分析天平稱量，所得質(zhì)量減去稱量瓶質(zhì)量為小球藻細(xì)胞干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻適宜碳源選擇

碳源是微藻異養(yǎng)、兼養(yǎng)生長(zhǎng)最關(guān)鍵的影響因素，選擇合適的碳源對(duì)微藻異養(yǎng)、兼養(yǎng)生長(zhǎng)的生物量產(chǎn)量和產(chǎn)物組成起到極為關(guān)鍵的作用。不同的微藻對(duì)碳源的需求不同，一些微藻既能利用有機(jī)碳又能利用無(wú)機(jī)碳進(jìn)行兼養(yǎng)生長(zhǎng)，同時(shí)進(jìn)行呼吸過(guò)程和光合作用[16]。本研究以3種有機(jī)碳和2種無(wú)機(jī)碳為碳源，對(duì)小球藻生物量的影響見(jiàn)圖1，對(duì)小球藻比生長(zhǎng)速率的影響見(jiàn)圖2。從圖1可以看出：小球藻均能利用葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉進(jìn)行生長(zhǎng)，添加碳源的試驗(yàn)組生長(zhǎng)狀況均顯著優(yōu)于未添加碳源的對(duì)照組，其生物量分別是自養(yǎng)生長(zhǎng)的3.1、2.7、1.6、2.0、1.5倍。從圖2可以看出：添加碳源的試驗(yàn)組比生長(zhǎng)速率分別是自養(yǎng)生長(zhǎng)的2.5、2.4、1.6、2.0、1.7倍。其中，葡萄糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，最終生物量和比生長(zhǎng)速率分別是對(duì)照組的3.1和2.5倍。其原因可能與相同物質(zhì)量的碳源所含能量不同有關(guān)，如葡萄糖在代謝中能產(chǎn)生大約2.8 kJ/mol的熱量。

2.2 小球藻適宜培養(yǎng)方式

大量研究表明，許多微藻有利用外加碳源進(jìn)行兼養(yǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)的能力。如魚(yú)腥藻（Anabeana）HB1017株能利用果糖、葡萄糖、蔗糖為底物進(jìn)行化能異養(yǎng)生長(zhǎng)[17，18]。集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803可以在每天短時(shí)光照（5 min）條件下利用葡萄糖進(jìn)行光激活異養(yǎng)[19，20]，三角褐指藻（Pheaodactylum tricornutum Bohlin）具有兼養(yǎng)生長(zhǎng)的能力[21]。

本試驗(yàn)對(duì)小球藻自養(yǎng)、兼養(yǎng)和異養(yǎng)進(jìn)行比較研究，結(jié)果如圖3和圖4所示。小球藻能利用葡萄糖進(jìn)行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長(zhǎng)。在化能異養(yǎng)和光激活異養(yǎng)條件下，小球藻顏色依然為綠色，但生長(zhǎng)緩慢。在添加DCMU的光異養(yǎng)條件下，小球藻生長(zhǎng)狀況優(yōu)于化能異養(yǎng)和光激活異養(yǎng)，但培養(yǎng)12 d以后因葡萄糖耗盡而死亡。由于DCMU是光合作用抑制劑，在培養(yǎng)基中加入DCMU后，微藻細(xì)胞光系統(tǒng)Ⅱ的活性被抑制，阻斷了非環(huán)式電子傳遞，NADPH產(chǎn)生受阻，CO2不能被微藻同化吸收[22-24]。所以當(dāng)葡萄糖被耗盡時(shí)，如不再添加碳源，微藻細(xì)胞由于缺少生長(zhǎng)所必需的碳源而死亡。在本試驗(yàn)培養(yǎng)條件中，小球藻在兼養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況最好，兼養(yǎng)培養(yǎng)兼有光合自養(yǎng)與異養(yǎng)代謝的性質(zhì)，大多數(shù)微藻兼養(yǎng)的比生長(zhǎng)速率等于異養(yǎng)培養(yǎng)與自養(yǎng)培養(yǎng)比生長(zhǎng)速率之和（μ兼養(yǎng)=μ異養(yǎng)+μ自養(yǎng)）。在光合自養(yǎng)條件下，CO2作為惟一碳源維持微藻生長(zhǎng)，而在光異養(yǎng)條件下，非環(huán)式電子傳遞被阻斷，CO2不能被同化吸收，微藻只能利用有機(jī)碳進(jìn)行生長(zhǎng)，由圖4可知，小球藻光合自養(yǎng)比生長(zhǎng)速率（0.13）和光異養(yǎng)比生長(zhǎng)速率（0.19）之和（0.32）非常接近于兼養(yǎng)比生長(zhǎng)速率（0.33），基本可以認(rèn)定小球藻兼養(yǎng)培養(yǎng)比生長(zhǎng)速率等于光異養(yǎng)培養(yǎng)與自養(yǎng)培養(yǎng)比生長(zhǎng)速率之和（μ兼養(yǎng)=μ異養(yǎng)+μ自養(yǎng)）。培養(yǎng)10 d后，所得生物量產(chǎn)率如表1所示，小球藻化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長(zhǎng)的生物量產(chǎn)率分別是自養(yǎng)生長(zhǎng)的1.3、1.5、2.2、5.9倍。由此可知，兼養(yǎng)培養(yǎng)是獲得小球藻高密度、高產(chǎn)量、短周期培養(yǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)方式。

3 結(jié)論

小球藻能利用多種外加碳源進(jìn)行異養(yǎng)兼養(yǎng)生長(zhǎng)，在本試驗(yàn)所選的3種有機(jī)碳和2種無(wú)機(jī)碳源中，葡萄糖促進(jìn)其生長(zhǎng)的效果最為明顯。

小球藻比生長(zhǎng)速率從大到小依次為：兼養(yǎng)、光異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、化能異養(yǎng)及光合自養(yǎng)，其中兼養(yǎng)的比生長(zhǎng)速率等于光合自養(yǎng)培養(yǎng)與光異養(yǎng)培養(yǎng)比生長(zhǎng)速率之和。小球藻化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長(zhǎng)的生物量產(chǎn)率分別是自養(yǎng)生長(zhǎng)的1.3、1.5、2.2、5.9倍。兼養(yǎng)培養(yǎng)是獲得小球藻高密度、高產(chǎn)量、短周期培養(yǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)方式。

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