摘要：茶是世界上重要的無酒精飲料之一，同時具有很高的保健價值。近年來，在茶樹分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域取得了長足進(jìn)展，許多功能基因被分離和克隆，對這些基因的研究有助于從分子水平上掌握茶樹生物活性物質(zhì)的代謝調(diào)控機制，為茶樹品種改良提供新途徑。介紹了常用的基因分離技術(shù)原理及其在茶學(xué)研究中的應(yīng)用，將有助于從宏觀上把握茶樹分子生物學(xué)研究的現(xiàn)狀，為厘清科研思路提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶學(xué)；基因克??；表型差異克隆

中圖分類號：S571.1；Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-5953-05

基因組是生物體遺傳信息的攜帶者和傳遞者，其中基因是基因組中編碼蛋白質(zhì)的序列，基因的選擇性表達(dá)對應(yīng)了生物體生長和發(fā)育的不同階段，揭示了生命活動的內(nèi)在機理。在農(nóng)作物育種中，對決定其重要農(nóng)藝性狀的功能基因的研究在遺傳改良中具有重要作用，對農(nóng)作物分子生物學(xué)水平的研究具有重大的應(yīng)用價值。因為轉(zhuǎn)基因作物巨大的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益，現(xiàn)在國內(nèi)外的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都十分重視轉(zhuǎn)基因作物的研究和應(yīng)用，國內(nèi)已大量種植轉(zhuǎn)基因的抗蟲棉花、大豆等。2009年國家農(nóng)業(yè)部通過了轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米和轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的生物安全性評價，可用于商業(yè)生產(chǎn)。因為茶樹是小作物，而且有自交不親和、生長周期長等特點，所以茶樹基因組研究基礎(chǔ)比較薄弱。自1994年Takeuchi等[1]報道了第一條茶樹基因CHS（查爾酮合成酶）序列以來，取得了較快的發(fā)展。如今，NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中已提交的茶樹基因編碼序列達(dá)到197條，其中全長序列占137條；預(yù)測的蛋白質(zhì)序列478條；提交的EST序列達(dá)到12 664條。但是到目前為止已提交的基因編碼序列中有大量的基因功能未知，重要功能基因僅停留在分離和克隆階段，很多生物活性物質(zhì)如兒茶素、茶氨酸的代謝途徑尚不清楚。因此，對茶樹功能基因的克隆和初步研究將在一段時間內(nèi)繼續(xù)成為茶樹分子生物學(xué)研究的主流，把握其研究現(xiàn)狀和相關(guān)的技術(shù)將為以后的科研工作提供理論依據(jù)，具有重要的參考價值。

常用的基因克隆方法大致可以分為序列克隆、功能克隆、定位克隆、表型差異克隆和測序克隆5種，下面將分別介紹這幾種基因克隆方法的原理及其在茶學(xué)研究中的應(yīng)用。

1 序列克隆——根據(jù)已知基因部分或全長DNA或RNA序列獲得基因

1.1 PCR擴增結(jié)合RACE技術(shù)進(jìn)行基因克隆

當(dāng)已知目的基因的序列時（比如通過NCBI網(wǎng)站或者他人的文章得知基因序列）， 通常采用PCR 的方法來克隆基因。其原理和方法是：①如果已知全長序列，對照該序列， 設(shè)計并合成1對寡核苷酸作引物， 提取所要從中分離基因的茶樹染色體DNA （如果提取的是RNA，則首先需要在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA 的第一條鏈）， 然后通過PCR反應(yīng)得到目的片段，測序后與已知序列進(jìn)行比對，因為同一條基因在物種內(nèi)和物種間均存在多態(tài)性，因此所得到的序列不一定與已知序列完全相同。②如果只知道序列片段，可以用上述方法先通過PCR技術(shù)得到基因片段，然后結(jié)合RACE（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)得到全長序列。此方法簡便、快速， 尤其適于經(jīng)費不足、分離一些重要基因起步較晚的情況。

β-葡萄糖苷酶與茶葉香氣物質(zhì)的形成有關(guān)，王讓劍等[2]根據(jù)GenBank登錄的這兩種酶蛋白的氨基酸序列設(shè)計引物，從龍井43中克隆得到GlUⅠ（β-葡萄糖苷酶Ⅰ）和GlUⅡ（β-葡萄糖苷酶Ⅱ）基因，在大腸桿菌中表達(dá)并純化出了有活性的蛋白，為其在茶葉加工研究以及在其他食品中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。類黃酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一類次級代謝產(chǎn)物， Lin等[3]根據(jù)已知的EST序列片段從茶樹中克隆得到全長FLS基因，并用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了有活性的蛋白。α-tubulin（α微管蛋白）是茶樹的看家基因，表達(dá)量比較穩(wěn)定，因此可以作為比較基因和蛋白表達(dá)水平時的內(nèi)參，譚振等[4]根據(jù)GenBank登錄的α-tubulin mRNA全長序列設(shè)計了引物，以RT-PCR方法擴增得到茶樹α-tubulin基因全長，將擴增產(chǎn)物用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組蛋白，并制備相應(yīng)的抗體，以期為茶樹功能蛋白的Western blot提供內(nèi)參。陳聰?shù)萚5]利用GenBank中公布的茶樹PCP （花粉壁蛋白基因）序列設(shè)計引物以龍井43為材料，采用PCR法擴增并測定了茶樹花粉壁蛋白基因內(nèi)含子序列，并通過序列分析推測該內(nèi)含子序列可能對PCP基因的表達(dá)起到調(diào)控作用。PPO基因（多酚氧化酶）對茶葉的品質(zhì)有重要影響，Liu等[6]根據(jù)已知序列，從宜紅早茶樹中克隆得到PPO基因，首次用原核系統(tǒng)表達(dá)出了有活性的PPO蛋白。Wu等[7]從5個不同的茶樹栽培種中克隆出了PPO基因，用原核系統(tǒng)表達(dá)獲得了活性蛋白，并用特殊的載體使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分析了這種變化對酶活性的影響。Kirita等[8]從一個印度茶樹栽培種中克隆了一個新的O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因。

1.2 根據(jù)跨種序列同源性克隆植物基因

生物的種、屬之間， 基因編碼序列的同源性大大高于非編碼區(qū)的序列。在植物或微生物中的同源基因已被克隆的前提下， 可先構(gòu)建目的物種的cDNA 文庫或基因文庫， 然后以已知的同源基因（或者部分序列） 為探針來篩選目的文庫獲得目的基因。1994年Takeuchi等[1]用此方法克隆得到了3個查耳酮合成酶的基因序列CHS1、CHS2和CHS3，這是茶樹種最早克隆得到的基因，筆者還分析了光線和各種糖對它們表達(dá)水平的影響。同年，Matsumoto等[9]用以水稻PAL（苯基丙氨酸解氨酶）的cDNA為探針，從茶樹中克隆得到了PAL基因，同樣的方法還用于克隆得到了茶樹的β-tubuline基因[10]。ANR（花色素還原酶）是茶樹中具有抗氧化作用的活性物質(zhì)EGCG合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，鄭華坤等[11]根據(jù)GenBank已報道的不同植物ANR基因的保守區(qū)域設(shè)計1對特異引物得到茶樹ANR基因片段，進(jìn)而結(jié)合RACE技術(shù)從高EGCG茶樹品種中克隆得到ANR基因全長序列，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)得到了預(yù)期大小的蛋白。類黃酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一類次級代謝產(chǎn)物，茶樹FS（黃酮合成酶）基因是類黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶，喬小燕等[12]根據(jù)其他物種保守序列設(shè)計兼并引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆得到了FSⅡ基因，并分析了其在不同部位的表達(dá)水平，對于從分子水平認(rèn)識、調(diào)控茶樹類黃酮化合物的生物合成，進(jìn)行遺傳改良具有現(xiàn)實意義。

2 功能克隆——根據(jù)基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)克隆基因

對于未知基因序列， 但其生理生化及代謝途徑比較清楚的蛋白質(zhì)，通常采用功能克隆的方法獲得基因。首先， 分離和純化目的蛋白質(zhì)或者多肽，并對它們進(jìn)行氨基酸序列分析， 根據(jù)氨基酸序列反推出DNA編碼序列，然后設(shè)計特異性引物，采取PCR的方法克隆出該基因。

1999年Kato等[13]純化到了TCS（咖啡因合成酶）的蛋白，分析了酶動力學(xué)。2000年通過對該蛋白進(jìn)行測序[14]，利用RACE技術(shù)克隆得到了TCS1基因的全長和UTR序列，并在大腸桿菌中表達(dá)得到了有活性的蛋白。因為茶樹的很多重要的酶，如茶氨酸合成酶蛋白質(zhì)非常不穩(wěn)定，難以得到純的蛋白，所以很難用這種方法得到編碼基因序列，目前應(yīng)用并不多。但是隨著蛋白質(zhì)純化技術(shù)的進(jìn)步，功能克隆技術(shù)將在茶樹分子生物學(xué)特異性功能基因的克隆中發(fā)揮難以替代的作用。

3 定位克隆——根據(jù)連鎖圖譜和標(biāo)簽來定位和克隆基因

定位克隆的前提是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜或者有標(biāo)簽的突變體庫。構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的方法為：首先利用SSR 等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行基因定位，然后以緊密連鎖的分子標(biāo)記為起點，篩選DNA YAC文庫，構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，通過染色體步移逐步向目標(biāo)基因靠近，最終克隆到目的基因并通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補試驗證實基因功能。操作前提是具有一個根據(jù)目的基因的有無而建立起來的遺傳分離群體；構(gòu)建精細(xì)的遺傳連鎖圖譜，能夠?qū)⒛康幕蚨ㄎ坏饺旧w的特定位置；還需要構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫作為以連鎖的分子標(biāo)記篩選目的基因用。這種方法在水稻、玉米、小麥、甘藍(lán)等的一些研究中應(yīng)用廣泛。常常用來分離克隆與質(zhì)量性狀如抗病性，數(shù)量性狀如產(chǎn)量等相關(guān)的基因。茶樹因為自交不親和、生長周期長等特點，遺傳圖譜構(gòu)建較為困難，還未見通過此方法克隆得到基因的報道。轉(zhuǎn)座子和T-DNA標(biāo)簽技術(shù)適用易于遺傳轉(zhuǎn)化和基因組全序列已知的物種，在水稻、擬南芥的研究中廣泛使用，取得了大量的科研成果，但是在茶樹研究中還沒有應(yīng)用。

4 表型差異克隆——根據(jù)表型差異或組織器官特異表達(dá)差異克隆基因

4.1 DDRT-PCR

DDRT-PCR 技術(shù)適用于多個樣品間的比較，且操作簡便，靈敏度高，應(yīng)用較為廣泛。在動物中QM基因編碼核糖體蛋白L10，與癌癥的抑制有關(guān)。Singh等[15]以茶樹干旱、GA和ABA處理過的樣品為研究對象，通過DDRT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆到了茶樹的QM類似基因，通過對該基因的表達(dá)調(diào)控分析發(fā)現(xiàn)其與旺盛的生長有關(guān)，受干旱和ABA的抑制，受GA的誘導(dǎo)。Sharma等[16]以干旱處理、ABA處理和對照3個茶樹mRNA文庫為材料，用DDRT-PCR技術(shù)首次得到了茶樹的3個干旱相關(guān)EST序列，分析了其對干旱和ABA的應(yīng)答。王新超等[17]對安吉白茶正常和白化葉片進(jìn)行差異基因的篩選，得到5個已知的和7個未知的基因片段，對這些基因的研究將有助于了解安吉白茶葉片白化的分子機理。韋朝領(lǐng)等[18]利用DDRT-PCR技術(shù)初步研究了茶樹被害蟲茶尺蠖取食后基因表達(dá)譜差異，得到222條差異片段，并對其中20條進(jìn)行了分類，為揭示茶樹的茶尺蠖防御機制提供了試驗依據(jù)。

4.2 cDNA-AFLP

cDNA-AFLP技術(shù)具有重復(fù)性好、假陽性低等優(yōu)點，是迄今為止茶樹表型差異克隆中應(yīng)用最多的一種技術(shù)。Fang等[19]在研究花發(fā)育相關(guān)基因過程中克隆得到Tua1基因，該基因與α-tubulin基因同源，用原核系統(tǒng)表達(dá)出了蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以促進(jìn)花粉管的生長，有證據(jù)表明該基因可能與雄性不育相關(guān)。余梅等[20]以大葉烏龍發(fā)育早期和晚期的花蕾為材料，用cDNA-AFLP技術(shù)分析了差異表達(dá)的基因，克隆得到了CsPSP1（花粉特異表達(dá)基因），與煙草PSP1基因同源性高達(dá)81%，分析其內(nèi)含子和序列特征，并推測該基因可能在花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長中起作用。在擬南芥中的研究表明14-3-3 蛋白是一個調(diào)節(jié)蛋白，能與許多功能不同的信號蛋白結(jié)合，其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等過程有重要作用，是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的重要信號分子，余梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)茶樹中也存在14-3-3蛋白，且僅在花發(fā)育晚期表達(dá)。作為喜熱植物，抗寒性對江北茶樹種植十分重要，陳暄等[22]利用cDNA-AFLP 技術(shù)進(jìn)行了茶樹低溫脅迫處理的基因表達(dá)差異分析，獲得低溫誘導(dǎo)后特異表達(dá)的差異片段，經(jīng)BLAST 比對發(fā)現(xiàn)該片段與白菜、擬南芥、煙草的抗寒基因CBF（C-repeat binding factor）分別有94%、84%、81%的同源性，而后通過RACE技術(shù)獲得該片段cDNA全長序列。房婉萍等[23]用同樣的方法得到了另一個冷誘導(dǎo)基因CBF和H1-histone1。陳暄等[24]分析了結(jié)實率差異顯著的龍井43和大葉烏龍2個茶樹品種在花蕾發(fā)育過程中基因表達(dá)的差異。從獲得的差異圖譜中，克隆得到一個與茶樹花發(fā)育相關(guān)的鈣依賴蛋白激酶基因片段，然后用RCAE方法擴增獲得其cDNA全長序列，命名為茶樹TCK基因。陳林波等[25]利用cDNA-AFLP 技術(shù)結(jié)合RACE技術(shù)獲得了茶樹低溫誘導(dǎo)的一個轉(zhuǎn)錄因子RAV基因，與多種植物RAV蛋白具有高度同源性。通過對基因表達(dá)模式的分析推測該基因在組織中的表達(dá)受到嚴(yán)格控制，而且在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

4.3 SSH

作為表型差異克隆技術(shù)的一種，SSH技術(shù)較為先進(jìn)，具有假陽性低、敏感性高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點。在煙草、水稻、柑橘、油菜等抗性基因的分離中應(yīng)用較多。在茶樹中尚未見報道。

5 測序克隆——通過測定DNA序列克隆基因

5.1 EST測序

表達(dá)序列標(biāo)簽EST（Expressed sequence tag）是源于mRNA（cDNA）短的、單向測定的序列片段[30，31]， 也是一種發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因表達(dá)譜的有效工具。近年來， 構(gòu)建cDNA文庫并進(jìn)行大規(guī)模測序已成為一種高效率、低成本的發(fā)現(xiàn)新基因的技術(shù)，在茶學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。Chen等[32]構(gòu)建了龍井43和安吉白茶2個茶樹品種新梢的cDNA文庫，在大量測定龍井43 cDNA文庫EST序列的基礎(chǔ)上，獲得了CHI（查爾酮異構(gòu)酶）和FS（黃酮醇合成酶）等基因。在已有EST文庫的基礎(chǔ)上，張亞麗等[33]克隆得到了ACC氧化酶全長基因并進(jìn)行了表達(dá)譜分析，推測可能與抗寒性狀有關(guān)。紫陽1號是一個常年不開花不結(jié)果的特異茶樹種質(zhì)，李冬花等[34]以紫陽1號新梢為材料，構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行了EST測序，獲得了大量已知功能基因、46個未知功能基因和26個未找到同源序列的基因。這些成果將為茶樹花發(fā)育相關(guān)研究提供理論依據(jù)。因為基因表達(dá)具有組織和器官特異性，史成穎等[35]以茶樹嫩根為材料構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)行了EST測序，初步確定已知功能基因734個， 推定功能基因102個， 未知功能基因178個。這些結(jié)果既為進(jìn)一步分離克隆茶樹根部功能基因奠定了基礎(chǔ)， 又為以后差異雜交獲取茶樹根部特定代謝途徑的酶基因及相關(guān)的調(diào)控基因提供了平臺。

5.2 全基因組測序

一個生物的全基因組序列蘊藏著這一生物的起源、進(jìn)化、發(fā)育、生理及所有與遺傳性狀有關(guān)的重要信息。對農(nóng)作物進(jìn)行全基因組測序?qū)⒋蟠蠹涌炱浞肿由飳W(xué)研究進(jìn)程，加快良種培育的速度。迄今為止，擬南芥、水稻、玉米、高粱、大豆、野草莓等農(nóng)作物的全基因組測序已經(jīng)完成。棉花全基因組測序已經(jīng)啟動。茶樹的全基因組測序也在進(jìn)行中。

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