摘要：以山羊小腦cDNA為模板，利用RT-PCR法擴增獲得了SPRN基因完整編碼區(qū)片段，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109后，篩選并鑒定陽性克隆，通過序列測量，將序列正確的片段雙酶切后連接到真核表達載體pEGFP-N1上。結果表明，成功構建了山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的真核表達載體。

關鍵詞：山羊；SPRN基因；RT-PCR；真核表達載體

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5618-03

SPRN基因編碼Shadoo（簡稱Sho）蛋白，在結構上與PrPc類似。Sho蛋白約包括130～150個氨基酸，N端保守，含有最多6個富含Arg的四肽XXRG（X是G、A或S）重復的堿性區(qū)域和約20個AA與PrPc有非常高同源性的疏水區(qū)。與N端相比，C端不夠保守，與PrP差異較大，包含一個糖基化位點，末端是GPI錨的信號肽。Sho蛋白氨基酸在不同物種中差異不大[1]。

Sho蛋白具有與PrPc相似的神經(jīng)保護作用，因此認為SPRN基因是一個與TSEs有關的一個候選基因[2]。2007年8月發(fā)現(xiàn)了稱為‘Shadoo’的朊病毒蛋白，證明了這種理論上的病毒蛋白真正存在，同時也觀測到了這種病毒在朊病毒傳染病過程中的意外改變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Shadoo蛋白具有類似于PrPc的保護性，降低了朊蛋白感染的水平[3]。這一發(fā)現(xiàn)可能會對于朊病毒蛋白的功能，朊病毒如何在動物之間進行傳播，以及如何導致腦細胞死亡等問題的研究提供新的思路。SPRN基因在小鼠、綿羊、倉鼠、人、大鼠和牛腦組織轉(zhuǎn)錄水平高，在其他組織中也檢測到表達[4-10]。本研究以小腦組織作為試驗材料擴增構建了山羊SPRN基因的真核表達載體，為研究該基因的表達定位、抗體制備以及蛋白的功能提供了必要的條件。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶、引物合成與測序、DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；Trizol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T、Taq DNA聚合酶、GC Buffer Ⅱ、dNTPs購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山羊小腦組織總RNA的提取 RNA的提取按照Trizol試劑說明書進行。

1.2.2 特異性引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中山羊SPRN基因的序列，利用Prime Premier 5.0 軟件設計引物，并在正向引物引入限制性Bgl Ⅱ酶切位點5′-GAAGATCTGAGGTCTCCTCCGTCCT-3′，在反向引物引入EcoRⅠ酶切位點5′-CGGAATTCCACAGGCCTACCGCA-3′。

1.2.3 山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的PCR擴增

1）cDNA第一鏈的合成。以提取的山羊小腦組織總RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA第一鏈合成：配制模板RNA 10 μL，oligo（dT）18 primer 5.00 μL，RNase free dH2O 15 μL的混合液；70 ℃保溫10 min，冰浴2 min。短暫離心后分別加入10 μL 5×M-MLV Buffer，2.50 μL 10 mmol/L dNTP Mixture，1.25 μL Recombinant Ribonuclease Inhibitor，1.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV和5.00 μL RNase free dH2O；42 ℃ 60 min，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻。所得產(chǎn)物直接用于PCR。

2）PCR擴增。PCR反應總體積為20 μL，含10×LA PCR Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向和反向引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板 1 μL，LA Taq DNA聚合酶 0.4 μL?；靹蚝笏查g離心，于PCR儀中進行擴增反應。PCR反應程序為：96 ℃預變性3 min；96 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并按照試劑盒說明書回收產(chǎn)物。

1.2.4 山羊SPRN基因與T載體的連接、轉(zhuǎn)化、篩選與測序 將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上。反應體系總體積為10 μL，其中Slution Ⅰ 5 μL，pMD19-T載體1 μL，純化的PCR產(chǎn)物4 μL，16 ℃連接3 h。在-80 ℃冰箱取100 μL感受態(tài)細胞放置冰上，待融化后，將5 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞，在冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，立即冰浴2 min，加入890 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩（180 r/min）1 h，離心（4 000 r/min，2 min），棄掉一部分上清液，取200 μL涂于預鋪有IPTG和X-gal的含Amp瓊脂平板上，37 ℃平放1 h后倒置培養(yǎng)過夜。

1.2.5 構建真核表達載體

1）pMD19-T-SPRN和pEGFP-N1載體的雙酶切?？傮w積為50 μL，10×Buffer 5 μL，Bgl ⅡⅠ 2.5μL，EcoRⅠ 2.5 μL，質(zhì)粒DNA 20 μL，去離子水20μL。37 ℃，酶切3 h。

2）pEGFP-N1-SPRN的構建。 取雙酶切后的SPRN基因完整編碼區(qū)片段5 μL，酶切后的pEGFP-N1 1 μL，10×T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，雙蒸水2 μL，總體積為10 μL，混勻，于37 ℃孵育3 h，然后于65 ℃終止反應。取連接后的產(chǎn)物5 μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，篩選陽性克隆質(zhì)粒，進行電泳和酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 山羊SPRN基因的PCR擴增與克隆測序

2.1.1 山羊小腦組織總RNA的完整性 利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的完整性，結果如圖1。從圖1可以看到清晰的28S rRNA、18S rRNA兩條主帶以及較弱的5S rRNA帶，表明所提取的總RNA完整性較好，純度較高，可用于RT-PCR反應。

2.1.2 山羊SPRN基因的PCR擴增 利用RT-PCR擴增山羊SPRN基因完整編碼區(qū)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結果顯示，得到了一條特異性條帶，與預期片段大小一致，約為488 bp，擴增的特異性較強（圖2）。

2.2 山羊SPRN基因重組真核表達載體pEGFP-N1-SPRN的酶切鑒定

利用瓊脂糖凝膠電泳對酶切后的重組陽性真核表達載體pEGFP-N1-SPRN進行檢測，電泳結果與預計的結果相一致，酶切片段大小分別為4 700 bp和488 bp，表明山羊SPRN基因完整編碼區(qū)已成功地克隆到pEGFP-N1載體上（圖3）。

3 討論

經(jīng)過對構建的真核表達載體測序，結果證明，所克隆的山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的序列是正確的。山羊SPRN基因完整編碼區(qū)經(jīng)雙酶切后連接于pEGFP-N1載體上。pEGFP-N1全長為4.7 kb，構建的pEGFP-N1-SPRN載體長度約為5.2 kb，酶切鑒定結果表明，SPRN基因完整編碼區(qū)成功克隆到了真核表達載體pEGFP-N1上，其在真核細胞中的表達為研究該基因的亞細胞定位與功能提供了必要的條件。

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（責任編輯 程碧軍）