摘要：以轉(zhuǎn)EGFP-attB基因PK15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞15）為試驗(yàn)材料，研究不同秋水仙素濃度、低滲時(shí)間對(duì)染色體標(biāo)本制備的影響。結(jié)果表明，使用秋水仙素濃度為0.04～0.08 μg/mL、低滲時(shí)間為15～20 min時(shí)所制備的染色體標(biāo)本分裂相分散好，可以做核型分析用，為下一步做染色體熒光原位雜交檢測(cè)研究轉(zhuǎn)EGFP-attB基因在染色體上的整合位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬腎細(xì)胞15；轉(zhuǎn)基因；EGFP-attB基因；核型分析

中圖分類號(hào)：Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5603-03

隨著國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)積極穩(wěn)妥地推動(dòng)實(shí)施，以及國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因及生物育種的研究、安全性評(píng)價(jià)和管理的重視，人們對(duì)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的意識(shí)逐漸加強(qiáng)[1-7]。目前，美、歐、日已經(jīng)開始授權(quán)動(dòng)物專利，而中國(guó)專利局暫不接受涉及動(dòng)植物的產(chǎn)品權(quán)利。轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物品種的育種人僅僅可對(duì)被轉(zhuǎn)基因及其應(yīng)用申請(qǐng)專利而間接保護(hù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物或動(dòng)植物品種，或?qū)ζ浞巧飳W(xué)的轉(zhuǎn)基因方法及其應(yīng)用申請(qǐng)專利保護(hù)，并以轉(zhuǎn)基因方法專利延及保護(hù)該轉(zhuǎn)基因方法直接獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物，所以，針對(duì)轉(zhuǎn)基因育種素材中外源基因的檢測(cè)越來(lái)越受到重視。轉(zhuǎn)基因豬的插入序列一般整合于宿主細(xì)胞染色體上，常以染色體原位雜交的方法來(lái)確定插入序列整合在某一條染色體的具體位點(diǎn)。本研究利用轉(zhuǎn)EGFP-attB基因PK15細(xì)胞制備染色體，為染色體原位雜交檢測(cè)外源基因在染色體上的整合位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），F(xiàn)BS（HyClone公司），PI（Sigma公司），無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen公司），Opti-MEM（Invitrogen公司），秋水仙素（Duchefa公司），Anti-digoxigenin-fluorescein、Nick-translation-Labeling-DNA-dUTP（Roche公司），正置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）、載玻片及蓋玻片（FanYi公司），LSM 510 META共聚焦顯微鏡（Zeiss公司）。

1.1.2 質(zhì)粒 PhiC31整合酶表達(dá)載體pCMV-Int和報(bào)告載體pBCPB+由斯坦福大學(xué)Michelle M. Calos教授饋贈(zèng)；表達(dá)載體pEGFP-N1、大腸桿菌DH5α、PK15細(xì)胞（豬腎細(xì)胞15）由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所生物技術(shù)研究室保藏。引物序列為：attB-F，5′-GTCATTAATCGCCATTCAGGCTGCGCA-3′；attB-R，5′-GTCATTAATCTCGGCCTCGACTCTAG

-3′。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 以attB-F和attB-R為引物，PCR擴(kuò)增attB基因序列，PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、dNTPs 2.0 μL、Taq DNA聚合酶1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模版 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。利用Ase Ⅰ酶切attB基因序列和pEGFP-N1載體，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR及酶切鑒定陽(yáng)性克隆，構(gòu)建為定點(diǎn)整合載體pEGFP-N1-attB。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 500 ng pCMV-Int、10 ng pEGFP-N1-attB、1.2 μL Lipofectamine 2000、適量的Opti-MEM混合后室溫下孵育20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后逐滴加到培養(yǎng)基中，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后加入600 μg/mL G418開始篩選。14 d后挑取單克隆，轉(zhuǎn)移到6孔板擴(kuò)繁、凍存。

1.2.3 探針標(biāo)記 采用Roche試劑盒DIG-nick translation mix標(biāo)記探針。取1 μg pEGFP-N1-attB質(zhì)粒溶解于16 μL ddH2O中，加入4 μL DIG-nick translation mix，瞬時(shí)離心混勻后于15 ℃作用90 min，加入1 μL 0.5 mmol/L EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)，然后加熱至65 ℃使酶失活，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 染色體制備 在培養(yǎng)終止前加入不同濃度的秋水仙素，處理2 h，胰酶處理細(xì)胞，收獲細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用2～5 mL的0.56% KCl溶液低滲細(xì)胞，低滲時(shí)間為15～60 min，然后加0.8～2.0 mL的固定液（甲醇∶冰醋酸，體積比為3∶1）輕輕混勻；1 000 r/min離心5 min，用1 mL新的固定液重新懸浮細(xì)胞，制片前根據(jù)懸浮細(xì)胞數(shù)調(diào)整懸液的體積，直接滴加細(xì)胞懸液至1～2片玻片上，每片2個(gè)雜交區(qū)（每個(gè)區(qū)域15～25 μL細(xì)胞懸液），晾干。

1.2.5 染色及雜交 在Gimsa染液中染色10 min，流水中洗去多余的Gimsa染液，晾干，在普通正置顯微鏡下觀察，找到分散好的分裂相并照相。37 ℃雜交16 h后，依次分別用50%甲酰胺、2×SSC、0.1×SSC洗滌，45 ℃洗2次，每次5 min，信號(hào)經(jīng)羅氏Anti-digoxigenin-fluorescein試劑盒放大。DAPI染色后在Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡下觀察，并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)PK15細(xì)胞驗(yàn)證

構(gòu)建成功的EGFP-attB基因表達(dá)載體（圖1）經(jīng)轉(zhuǎn)PK15細(xì)胞驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)EGFP-attB基因PK15細(xì)胞經(jīng)過(guò)14 d的G418篩選，發(fā)現(xiàn)全部表達(dá)綠色熒光蛋白（圖2），表明得到的是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，EGFP-attB基因已經(jīng)整合到PK15細(xì)胞的染色體上。

2.2 染色體標(biāo)本制備與染色

用穩(wěn)轉(zhuǎn)的PK15細(xì)胞為材料作染色體標(biāo)本，用Gimsa染色后在普通正置顯微鏡下觀察，找到分散好的分裂相（圖3）。從圖3可以看出，使用終濃度為0.04～0.08 μg/mL秋水仙素、低滲時(shí)間為15～20 min時(shí)所制備的染色體標(biāo)本分裂相分散好，可以做核型分析用。

2.3 共聚焦顯微鏡下的檢測(cè)

將所制標(biāo)本經(jīng)DAPI染色后在Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡下觀察，并采集數(shù)據(jù)。使用軟件LSM Image Examiner分析，染色體標(biāo)本分裂相分散好（圖4），可以做核型分析用。

3 小結(jié)與討論

應(yīng)用FISH（Fluorescence in situ hybridization）技術(shù)檢測(cè)外源基因的成功率受探針（種類、大小、標(biāo)記效率）、標(biāo)本（種類、處理方法）以及雜交、清洗條件、熒光抗體檢測(cè)、熒光顯微鏡靈敏度等因素影響。其中探針大小（分子雜交探針的有效長(zhǎng)度）對(duì)FISH檢出率具有限定作用，目前普遍認(rèn)為1 kb以下的探針難以成功用于FISH[8]。中期FISH檢出率較高，因?yàn)橹衅诜至严嗫赏ㄟ^(guò)染色體定位信號(hào)，不易受非特異信號(hào)干擾，且染色體分散，信號(hào)不易被覆蓋。而間期FISH則因特異信號(hào)與非特異信號(hào)呈現(xiàn)同一細(xì)胞核中，不易辨認(rèn)非特異信號(hào)，出現(xiàn)多信號(hào)（超過(guò)預(yù)期信號(hào)數(shù)）核，且可能由于信號(hào)有時(shí)不在同一平面上，出現(xiàn)少于預(yù)期信號(hào)數(shù)的核，檢出率較中期FISH低。在FISH應(yīng)用中，應(yīng)盡可能獲取高檢出率，但還要考慮信號(hào)特異性。FISH特異性取決于雜交特異性和免疫熒光檢測(cè)中抗原抗體反應(yīng)特異性，受相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件影響。因此，為獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，需根據(jù)探針和標(biāo)本情況改變實(shí)驗(yàn)條件，并觀察一定數(shù)量中期分裂相或間期細(xì)胞核，統(tǒng)計(jì)其檢出率，保證信號(hào)特異性。中期分裂相不易受非特異信號(hào)干擾，統(tǒng)計(jì)25個(gè)分裂相即可[9]。

本研究制備的染色體標(biāo)本分裂相分散好，染色體分散，信號(hào)不易被覆蓋，可以用于核型分析，為下一步做染色體熒光原位雜交檢測(cè)研究轉(zhuǎn)EGFP-attB基因在染色體上的整合位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）