摘要：采用硅膠常溫和濕沙低溫貯藏方法對白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]種子進(jìn)行貯藏生理研究，測定白木香種子貯藏期間的生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明，在硅膠常溫和濕沙低溫兩種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，茂名和中山兩產(chǎn)地白木香種子的含水量、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性以及可溶性糖和粗脂肪含量均發(fā)生一定變化，種子發(fā)芽率也均表現(xiàn)出不同程度下降，但在相同貯藏時(shí)間內(nèi)濕沙低溫貯藏組白木香種子的發(fā)芽率顯著高于硅膠常溫貯藏組，說明濕沙低溫貯藏環(huán)境更有利于維持白木香種子活力，保證種子的發(fā)芽率。

關(guān)鍵詞：白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]；種子；硅膠常溫貯藏；濕沙低溫貯藏；生理生化變化

中圖分類號：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5556-05

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]為瑞香科沉香屬植物，是我國珍稀植物資源，也是我國生產(chǎn)中藥沉香的惟一植物資源。近年來，由于白木香自然繁殖率低、生存環(huán)境被嚴(yán)重破壞、蟲害及人為掠奪式砍伐等原因，白木香資源遭到嚴(yán)重破壞， 于1999年被國務(wù)院批準(zhǔn)為國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，載入《中國植物紅皮書》[1]。白木香主要以種子繁殖，其種子為頑拗型種子，在普通貯藏方法下很容易脫水使種子失去活力，需隨采隨播，給生產(chǎn)和引種工作帶來很大的困難[2-4]。因此，研究白木香種子貯藏的生理生化特性以及探索一些可能的貯藏方法以延長白木香種子的壽命，對于揭示白木香種子及其他頑拗型種子的貯藏機(jī)理都具有一定的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 白木香種子 供試白木香種子分別采自廣東省中山市和茂名市。經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院李明教授鑒定為白木香種子。

1.1.2 儀器 試驗(yàn)用儀器主要有DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津）、BP211D電子天平（Sartorius，AG）、TGL-10M高速低溫離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 貯藏處理 硅膠常溫貯藏是在室溫（25±2） ℃條件下將白木香種子置于裝有硅膠的干燥器內(nèi)，濕沙低溫貯藏是將白木香種子分層埋在濕沙中貯藏在4 ℃條件下，兩種貯藏方法分別于貯藏0、1、2、4、7、15 d時(shí)取樣。

1.2.2 種子發(fā)芽率測定 將經(jīng)硅膠常溫貯藏和濕沙低溫貯藏的種子于溫度為26 ℃、空氣濕度為75%的條件下進(jìn)行發(fā)芽。每批處理20粒種子，3次重復(fù)，記錄發(fā)芽情況，計(jì)算發(fā)芽率。

1.2.3 種子含水量測定 參考國際種子檢驗(yàn)規(guī)程[5]進(jìn)行測定，種子含水量以鮮重記，采用烘干稱重法，烘干溫度為（103±2）℃，烘干時(shí)間為（17±1） h。

1.2.4 過氧化物酶（POD）活性測定 參考李玲等[6]的方法，測量470 nm處OD值，以每分鐘OD變化值表示酶活性大小。

1.2.5 過氧化氫酶（CAT）活性測定 參考李玲等[6]的方法，酶活性計(jì)算公式如下：

△OD240 nm=（OD240 nmF-OD240 nmI）/（tF-tI）

式中，tF為反應(yīng)終止時(shí)間（min），tI為反應(yīng)初始時(shí)間（min）。

CAT活性=（△OD240 nm×V）/（0.01×Vs×m）

式中，V為樣品提取液總體積（mL），Vs為測定時(shí)所取樣品提取液體積（mL），m為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.6 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 參考李玲等[6]的方法，于560 nm處測定OD值，以每分鐘抑制NBT光氧化還原50%的酶用量為一個(gè)酶活性單位。計(jì)算公式如下：

SOD活性=（ACK-AE）×VT/（0.5×ACK×W×V1×t）

式中，ACK為對照管的吸光度，AE為樣品管的吸光度，VT為樣品液總體積（mL），W為樣品鮮重（g），V1為測定時(shí)樣品用量（mL），t為光照反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.7 可溶性糖含量的測定 參考張志良等[7]的方法略作修改。

1.2.8 粗脂肪含量的測定 參考張志良等[7]的方法稍作修改。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種貯藏方法對白木香種子發(fā)芽率的影響

從圖1可以看出，在兩種貯藏方法下兩產(chǎn)地白木香種子發(fā)芽率均隨著貯藏時(shí)間延長而逐漸下降，硅膠常溫貯藏組在7 d時(shí)，中山和茂名白木香種子發(fā)芽率分別為47%和42%，至15 d時(shí)分別降為32%和27%；而濕沙低溫貯藏組在7 d時(shí)，中山和茂名白木香種子發(fā)芽率分別為72%和70%，至15 d時(shí)發(fā)芽率分別為67%和62%。

此外，兩種不同貯藏方法下種子發(fā)芽率之間存在顯著差異（P<0.05），而相同貯藏條件下相同時(shí)間內(nèi)兩產(chǎn)地種子發(fā)芽率之間并沒有顯著差異（P>0.05）。

2.2 兩種貯藏方法對白木香種子含水量的影響

茂名和中山兩個(gè)產(chǎn)地白木香種子在未貯藏前含水量分別為31.50%和23.78%，經(jīng)過硅膠常溫貯藏后，兩產(chǎn)地種子含水量均在貯藏后2 d迅速下降，隨后呈緩慢下降趨勢，貯藏至15 d時(shí)茂名白木香種子的含水量為4.73%，中山白木香種子的含水量為3.76%；經(jīng)過濕沙低溫貯藏后，兩產(chǎn)地種子含水量均呈現(xiàn)緩慢升高趨勢，但中山種子的含水量從貯藏至4 d開始便一直高于茂名種子（圖2），推測是由于未貯藏前中山種子的含水量相對較低，其在濕沙低溫環(huán)境中的吸脹作用更強(qiáng)一些。

2.3 兩種貯藏方法對白木香種子POD、CAT、SOD活性的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長，在硅膠常溫貯藏條件下兩產(chǎn)地白木香種子POD、CAT、SOD活性均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，中山產(chǎn)地白木香種子各酶的最高活性均出現(xiàn)在貯藏7 d，而茂名產(chǎn)地白木香種子均在貯藏4 d時(shí)各酶達(dá)到最高活性，隨后出現(xiàn)下降趨勢；在濕沙低溫貯藏條件下兩產(chǎn)地白木香種子POD、CAT、SOD活性均出現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢（圖3～圖5）。

2.4 兩種貯藏方法對白木香種子可溶性糖和粗脂肪含量的影響

由圖6可知，兩產(chǎn)地白木香種子在兩種不同貯藏條件下可溶性糖含量均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）。硅膠常溫貯藏組兩產(chǎn)地白木香種子可溶性糖含量變化趨勢相似，均表現(xiàn)為先升高后降低，白木香種子在貯藏前期由種胚和胚乳貯藏的可溶性糖以及淀粉的分解來提供可溶性糖，以供種子的呼吸作用，貯藏后期由于種子含水量太低，抑制了種子的呼吸作用而導(dǎo)致可溶性糖含量下降[8，9]。濕沙低溫貯藏組兩產(chǎn)地種子可溶性糖含量整體呈現(xiàn)下降趨勢，推測由于種子貯藏在低溫條件下呼吸作用被抑制，導(dǎo)致可溶性糖含量下降。對于可溶性糖含量變化的原因，Lynnette等[10]認(rèn)為細(xì)胞中可溶性糖的利用率對可溶性糖含量的變化有較大影響，錢俊芝等[11]也認(rèn)為種子浸出液可溶性糖含量與種子細(xì)胞對可溶性糖的利用有關(guān)，主要是與酸性磷酸酶的變化有關(guān)。

脂肪是種子主要的貯藏物質(zhì)之一，它與糖和蛋白質(zhì)共同構(gòu)成細(xì)胞的組成物質(zhì)。由圖7可知，硅膠常溫貯藏組兩產(chǎn)地白木香種子粗脂肪的含量均呈現(xiàn)略微上升趨勢，且兩產(chǎn)地粗脂肪含量差異達(dá)到顯著水平（P<0.05），粗脂肪含量出現(xiàn)上升趨勢可能是在硅膠干燥的環(huán)境中，種子不斷失水，使得粗脂肪含量升高。貯藏在濕沙低溫環(huán)境中的兩產(chǎn)地白木香種子粗脂肪含量均出現(xiàn)略微下降的趨勢，兩產(chǎn)地白木香種子粗脂肪含量差異也達(dá)到顯著水平（P<0.05），粗脂肪含量下降一方面可能是由于種子發(fā)生冷吸脹，導(dǎo)致其所占比例下降；另一方面可能在此環(huán)境中激活了白木香種子中的脂肪酶，使脂肪發(fā)生分解，含量下降[8]。

3 結(jié)論與討論

種子含水量對于種子發(fā)芽率有重要的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長，硅膠常溫貯藏條件下的發(fā)芽率在相同貯藏時(shí)間內(nèi)顯著低于濕沙低溫貯藏條件下的發(fā)芽率，且相同貯藏時(shí)間內(nèi)的含水量也較濕沙低溫貯藏組顯著降低。種子含水量對于種子活力及發(fā)芽能力有重要的影響，頑坳型種子之所以種子貯藏壽命短，與其種子的含水量有密切關(guān)系。大多數(shù)植物種子貯藏過程中，當(dāng)含水量降低時(shí)，壽命可以延長，但由于頑拗型種子成熟脫離母株后即進(jìn)入萌發(fā)狀態(tài)，進(jìn)行著旺盛的代謝活動(dòng)，種子一旦干燥失水其活力就會受到抑制[12]，因此對于頑拗型種子來說，采收后適宜的種子含水量對發(fā)芽率顯得至關(guān)重要。前人試驗(yàn)表明，頑拗型種子含水量降低，種子發(fā)芽率也隨著降低[13]，與本研究結(jié)果一致，本試驗(yàn)通過濕沙低溫貯藏表明白木香種子含水量過高也同樣不利于種子萌發(fā)，但其貯藏效果優(yōu)于硅膠常溫貯藏。

兩種貯藏方法下，隨著貯藏時(shí)間的延長，種子內(nèi)幾種抗氧化酶活性也發(fā)生變化。硅膠常溫貯藏條件下隨著種子含水量逐漸下降，POD、CAT、SOD的活性均先升高后降低，這表明抗氧化酶類在種子中發(fā)揮著協(xié)同作用，當(dāng)發(fā)生失水脅迫時(shí)，種子能通過啟動(dòng)酶防御系統(tǒng)來有效降低或消除自由基對膜脂的傷害，使膜脂不致發(fā)生過氧化從而得到保護(hù)，也因此會使酶的活性升高；但當(dāng)種子失水過多時(shí)，其對失水脅迫的防御能力減弱，又會使酶的活性迅速降低[14]。在濕沙低溫貯藏條件下，種子含水量逐漸升高，POD、CAT、SOD活性均呈現(xiàn)升高趨勢，推測在濕沙低溫貯藏條件下，白木香種子發(fā)生了低溫吸脹，在低溫逆境脅迫下，各酶的活性被激活，清除細(xì)胞代謝失調(diào)引起的過多超氧自由基，避免或減弱膜脂過氧化作用，減輕細(xì)胞質(zhì)膜體系的損傷，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低低溫逆境對種子的傷害[9]，盡管與硅膠常溫貯藏所面對的環(huán)境不同，但POD、CAT、SOD均通過改變自身活性來應(yīng)對各種逆境脅迫，然而濕沙低溫貯藏環(huán)境中的白木香種子POD、CAT、SOD的活性整體高于硅膠常溫貯藏組，種子發(fā)芽率也明顯高于硅膠常溫組。

可溶性糖是種子貯藏和萌發(fā)的直接呼吸底物[15]，在種子萌發(fā)過程中，可溶性糖既可作為能量來源被迅速分解，又可為胚細(xì)胞的伸長生長提供原料，是種子萌發(fā)過程中的重要營養(yǎng)物質(zhì)。隨著貯藏時(shí)間的延長，兩種貯藏方法下可溶性糖含量均發(fā)生一定的變化。硅膠常溫貯藏條件下中山和茂名兩產(chǎn)地白木香種子可溶性糖含量均表現(xiàn)為先升高后降低；濕沙低溫貯藏條件下兩產(chǎn)地種子可溶性糖含量整體呈現(xiàn)下降趨勢。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在種子貯藏過程中，可溶性糖的含量對于種子活力的保持和細(xì)胞膜的穩(wěn)定有著很大的作用。楊曉泉等[16]在研究花生種子耐脫水能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，伴隨著可溶性糖如蔗糖和寡糖含量的增加，花生胚耐脫水力增強(qiáng)，證明可溶性糖的存在與花生可溶性蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)花生胚軸耐脫水力的形成與還原性糖/可溶性糖比值有關(guān)，當(dāng)該比值降低時(shí)，種子活力會得到保持。本試驗(yàn)中盡管硅膠常溫貯藏下的白木香種子可溶性糖含量較高，但其發(fā)芽率卻低于濕沙低溫貯藏組，表明可溶性糖不是維持種子活力的惟一因素，這一點(diǎn)也在劉箭等[17]的研究中得到了證實(shí)。

脂肪作為種子三大貯藏物質(zhì)之一也在種子萌發(fā)過程中起著不可或缺的作用。硅膠常溫貯藏組中山和茂名兩產(chǎn)地白木香種子粗脂肪的含量均呈現(xiàn)略微上升趨勢；貯藏在濕沙低溫環(huán)境中的兩產(chǎn)地白木香種子粗脂肪含量均出現(xiàn)略微下降的趨勢。研究表明丙二醛是種子中不飽和脂肪酸氧化的最終產(chǎn)物，能夠引起種子膜系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷，這一結(jié)果表明脂肪代謝與種子活力相關(guān)性增強(qiáng)[18]，但也有學(xué)者認(rèn)為雖然脂肪代謝能夠?qū)е路N子活力喪失，但脂肪含量與種子活力相關(guān)性不大[19，20]。兩產(chǎn)地白木香種子在兩種貯藏條件下粗脂肪含量均有顯著差異（P<0.05），說明相對于硅膠常溫貯藏，濕沙低溫貯藏更能將種子粗脂肪含量控制在能夠維持種子活力的水平。

白木香種子在貯藏過程中發(fā)生的一系列生理生化變化是對種子衰老過程的響應(yīng)，也是該種子貯藏環(huán)境和貯藏特性的反映，各生理因子相互作用，共同影響白木香種子的貯藏壽命和效果。因此通過對白木香種子生理生化指標(biāo)的分析比較，進(jìn)而尋找一種合適的貯藏方法對實(shí)現(xiàn)白木香優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的長期保存具有重要的意義。

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（責(zé)任編輯 溫 亮）