摘要：探討了組織塊貼壁法及酶消化法（胰蛋白酶、膠原酶、胰蛋白酶-EDTA、胰蛋白酶-EDTA-膠原酶）對分離黃鱔（Monopterus albus）肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，酶消化法優(yōu)于組織塊貼壁法，其中胰蛋白酶-EDTA-膠原酶分次消化法所獲得細(xì)胞數(shù)量最多，為（1.30±0.06）×107個/g，胰蛋白酶消化法所得細(xì)胞活力最高，為（90.2±1.2）%，胰蛋白酶-EDTA-膠原酶分次消化法所獲得活細(xì)胞數(shù)量最多，為（1.10±0.05）×107個/g。細(xì)胞增殖能力呈先升后降的趨勢，在48 h細(xì)胞數(shù)量最多，144 h后細(xì)胞數(shù)量明顯下降。

關(guān)鍵詞：黃鱔（Monopterus albus）；肝細(xì)胞；分離；活性；培養(yǎng)

中圖分類號：S917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5543-03

肝臟是脊椎動物最大的解毒和營養(yǎng)代謝器官，是目前藥理學(xué)、毒理學(xué)和生理學(xué)等研究的主要對象。已有大量研究表明，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞可作為活體肝組織替代模型應(yīng)用于藥理、毒理、生理等方面的研究。魚類的肝細(xì)胞培養(yǎng)晚于哺乳動物，目前已有報道40多種魚類的肝細(xì)胞被分離并進(jìn)行體外培養(yǎng)，包括常見的草魚（Ctenopharyngodon idellus）[1]、鯉（Cyprinus carpio）[2]、鯽（Carassius auratus）[3]、羅非魚（Oreochromis Niloticus）[4]等，花鱸（Lateolabrax japonicus）[5]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[6]等魚類的肝細(xì)胞已建立細(xì)胞系。這些原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞以及已建立的肝細(xì)胞系也被廣泛應(yīng)用于藥理、毒理、生理等方面的研究[7]。黃鱔（Monopterus albus）屬合鰓魚目合鰓魚科黃鱔屬，是一種無鱗魚類，目前關(guān)于黃鱔肝細(xì)胞的培養(yǎng)及應(yīng)用還鮮見報道。本研究比較了不同分離方法對黃鱔肝細(xì)胞的數(shù)量、活力及增殖能力的影響，為建立黃鱔肝細(xì)胞體外培養(yǎng)體系及作為黃鱔的藥理、毒理、生理學(xué)等相關(guān)研究的體外模型的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗黃鱔體重約為50 g，飼養(yǎng)于長江大學(xué)黃鱔養(yǎng)殖基地。

1.2 試劑

PBS（Hyclone公司），青鏈霉素、臺盼藍(lán)、胰蛋白酶、MTT（Amresco公司），小牛血清、M199培養(yǎng)基（Gibco公司）。

1.3 方法

1.3.1 肝細(xì)胞的分離 ①組織塊貼壁法。將黃鱔斷尾放血處死，在體積分?jǐn)?shù)為70%的無水乙醇中浸泡5 min，在超凈工作臺中取出肝胰臟組織，放入培養(yǎng)皿中用預(yù)冷的PBS溶液進(jìn)行漂洗。用眼科剪剪成1～2 mm3的小塊并除去雜質(zhì)。將組織塊轉(zhuǎn)入24孔板內(nèi)，每孔放2～3塊，靜置2～3 h使組織塊貼壁，吸走多余液體后每孔加2 mL培養(yǎng)液，置于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，每24 h倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。②胰蛋白酶消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶室溫消化20 min，用血清終止其消化并收集肝細(xì)胞，用100目篩網(wǎng)過濾并收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，隨后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞重懸液。③膠原酶消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化60 min，用血清終止其消化并收集肝細(xì)胞，用100目篩網(wǎng)過濾并收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，隨后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞重懸液。④胰蛋白酶-EDTA消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶-EDTA，室溫磁力攪拌消化30 min，用血清終止消化并收集細(xì)胞，用100目篩網(wǎng)過濾并收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，隨后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞重懸液。⑤胰蛋白酶-膠原酶-EDTA消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化30 min，然后加入體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶-EDTA 4 ℃消化30 min，用血清終止消化并收集肝細(xì)胞，用100目篩網(wǎng)過濾并收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)3次，隨后加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞重懸液。

1.3.2 肝細(xì)胞活力的測定 將細(xì)胞重懸液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的臺盼藍(lán)按9∶1混合，在顯微鏡下血球計數(shù)板上計數(shù)?；罴?xì)胞為圓形透明，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占總計數(shù)細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力。

1.3.3 肝細(xì)胞的原代培養(yǎng) 用含10%（V/V）小牛血清的M199培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度（1×107個/mL）接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL，25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.3.4 肝細(xì)胞增殖率的測定 每天向12孔中加入80 μL新鮮培養(yǎng)基和20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去全部培養(yǎng)液，加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕吹打至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀490 nm波長下測定吸光度，連續(xù)測定8 d。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)采用Statistic 6.0（StatSoft Software，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著性用t檢驗分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分離方法對黃鱔肝細(xì)胞數(shù)量的影響

采用組織塊培養(yǎng)法分離黃鱔肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，組織塊貼壁生長，24 h后組織塊周圍有少量圓形透亮的單細(xì)胞遷出，但隨后幾天未見大量細(xì)胞遷出生長成片的現(xiàn)象，且組織塊邊緣模糊，遷出細(xì)胞逐漸死亡。

采用4種酶消化法對黃鱔肝細(xì)胞進(jìn)行分離，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種方法對每克重量肝組織所獲得的肝細(xì)胞數(shù)量有所不同。其中，采用0.25%的胰蛋白酶室溫消化20 min可獲得的細(xì)胞數(shù)量為（8.20±0.50）×106個/g；采用0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化60 min可獲得的細(xì)胞數(shù)量為（9.80±0.40）×106個/g；采用0.25%的胰蛋白酶-EDTA，室溫磁力攪拌消化30 min可獲得的細(xì)胞數(shù)量為（1.00±0.04）×107個/g，與采用0.1%的膠原酶消化法所獲得的細(xì)胞數(shù)量差異不顯著（P>0.05）；而先采用0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化30 min，0.25%的胰蛋白酶-EDTA 4 ℃消化30 min，所獲得的細(xì)胞數(shù)量最多，為（1.30±0.06）×107個/g。

2.2 不同分離方法對黃鱔肝細(xì)胞活力的影響

采用臺盼藍(lán)法測定了4種消化法分離的活細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，不同分離方法所獲得的有效肝細(xì)胞（即活細(xì)胞）的細(xì)胞數(shù)量之間均有顯著性差異（P<0.05），4種消化分離方法所獲得的有活力的肝細(xì)胞數(shù)量分別為（7.40±0.40）×106個/g，（9.10±0.50）×106個/g，（8.00±0.30）×106個/g，（1.10±0.05）×107個/g，其中，采用胰蛋白酶-膠原酶-EDTA消化法可獲得的活細(xì)胞數(shù)量最多。

通過比較4種分離方法對黃鱔肝細(xì)胞的總數(shù)量和活細(xì)胞數(shù)量的影響可見，4種分離方法對肝細(xì)胞的活力影響不同（圖3），其中胰蛋白酶和膠原酶消化法對細(xì)胞的損傷最小，活力分別為（90.2±1.2）%和（89.8±2.0）%，兩者之間差異不顯著（P>0.05），與另兩種分離方法有顯著差異（P<0.05）。胰蛋白酶-EDTA消化法所分離細(xì)胞的活力最低，為（80.4±1.5）%，而3種酶混合作用所得的細(xì)胞活力為（85.9±1.7）%。

2.3 MTT法測定不同時間黃鱔肝細(xì)胞的吸光度

將膠原酶消化法分離的肝細(xì)胞按1×107個/mL每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置連續(xù)培養(yǎng)，每24 h測定其中每豎排12孔的吸光度，連續(xù)測定8 d（圖4），吸光度反映了黃鱔肝細(xì)胞的增殖能力。由圖4可知，黃鱔肝細(xì)胞增殖能力隨著時間延長呈先上升后趨于下降的趨勢。其中肝細(xì)胞接種24～48 h階段吸光度有顯著增加（P<0.05），細(xì)胞有明顯的增殖現(xiàn)象；72～120 h期間吸光度相對穩(wěn)定，細(xì)胞未繼續(xù)增殖；144 h之后，吸光度顯著下降，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞開始逐漸死亡。

3 小結(jié)與討論

魚類細(xì)胞分離方法主要有組織塊法、機械分離法、酶消化法和二步灌流法。研究表明不同分離方法影響細(xì)胞的分離數(shù)量和活力。組織塊消化法是最簡單的細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法，常用于分離易分裂增殖的細(xì)胞，并且大多可建成細(xì)胞系。但是肝組織較其他組織而言，肝細(xì)胞是機體內(nèi)較為成熟的細(xì)胞，細(xì)胞自身遷出需較長時間。對大口黑鱸（Micropterus salmoides）[8]和中華鱘（Acipenser sinensis）[9]的肝組織采用組織塊貼壁法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果細(xì)胞不能從肝組織塊中遷出；魯氏銀板魚（Metynnis roosevelti）[10]的肝細(xì)胞可以從肝組織塊中遷出，但所需時間較長，且細(xì)胞活力低，無法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。而花鱸[5]和半滑舌鰨[6]可以利用組織貼壁培養(yǎng)法分離出肝細(xì)胞。本研究中貼壁后第一天即可見黃鱔肝細(xì)胞從組織塊中遷出，但是隨后遷出細(xì)胞逐漸死亡，組織塊邊緣變模糊，可能遷出的細(xì)胞并非肝細(xì)胞或肝細(xì)胞活力較差，無法生長和增殖。

酶消化法是目前采用極為廣泛的方法，該法主要依靠各種酶的作用破壞細(xì)胞間的結(jié)締組織等之間的聯(lián)系，加上外界條件適宜，較組織塊法更容易分離獲得大量的單細(xì)胞，適用于絕大多數(shù)的組織器官。其中不含Ca2+的螯合劑（EDTA等）可以螯合掉肝組織中的Ca2+，從而可以打破固定細(xì)胞的細(xì)胞橋粒等細(xì)胞連接，但是EDTA的分散效果較差，常與酶液聯(lián)合使用。酶消化法常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶，胰蛋白酶作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間的黏蛋白及糖蛋白等，從而可以使細(xì)胞分離。膠原酶能特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織，是肝細(xì)胞的常用酶。本研究中分別采用單酶法和混合酶法進(jìn)行黃鱔肝細(xì)胞的分離，并對其細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，胰蛋白酶-膠原酶-EDTA消化法可獲得的活細(xì)胞數(shù)量最多，更適宜用于黃鱔肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）