摘要：以產(chǎn)油酵母菌Y1為試驗(yàn)菌株，通過(guò)確定出發(fā)菌株Y1的最佳紫外誘變時(shí)間，誘變后菌株的初篩和復(fù)篩，得到了一株突變菌株Y9。測(cè)得Y9的油脂產(chǎn)量為5.25 g/L，油脂含量為23.85%。與菌株Y1油脂產(chǎn)量2.11 g/L、含油量9.6%相比，Y9的產(chǎn)油量有明顯提高，因此擬選取油脂產(chǎn)量較高的Y9作為后續(xù)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂研究的實(shí)驗(yàn)菌株。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)油酵母；紫外誘變；誘變選育；油脂產(chǎn)量

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5463-03

我國(guó)人均石化資源貯量十分有限，而能源需求量卻與日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潛在油源[1]。由微生物生產(chǎn)富含多種生理功能的不飽和脂肪酸油脂已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛重視，因此微生物油脂的研究將成為21世紀(jì)油脂工業(yè)的一個(gè)重要方向[2]。微生物油脂，又稱(chēng)單細(xì)胞油脂，是由酵母、霉菌和細(xì)菌等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚?，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的油脂[3]。自然界中一些產(chǎn)油微生物在碳源充足而其他營(yíng)養(yǎng)成分（通常為氮源）缺乏情況下，可以在胞內(nèi)大量積累油脂，甚至達(dá)到自身干重60%以上[4]。產(chǎn)油酵母產(chǎn)脂發(fā)酵生產(chǎn)通常以單糖作為碳源，許多廉價(jià)原料如油料作物秸稈、煉油餅渣、廢糖液等通過(guò)化學(xué)或生物水解方式降解成單糖后可用于產(chǎn)油酵母產(chǎn)脂發(fā)酵[5，6]。

本研究以產(chǎn)油酵母菌Y1為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)不同紫外誘變時(shí)間進(jìn)行研究，確定Y1的最佳紫外誘變時(shí)間，對(duì)誘變后菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩后獲得油脂產(chǎn)量較高的突變菌株，以期為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)油酵母菌Y1，包頭師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 蘇丹黑B染色液，蘇丹黑B 0.5 g，加入75%乙醇100 mL，水浴加熱使其充分溶解，待其冷卻后過(guò)濾，得出的濾液即為蘇丹黑B染色液。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，（NH4）2SO4 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，酵母粉0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。基礎(chǔ)發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨1.5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 初始菌株含油量測(cè)定

1）酵母菌Y1種子液的培養(yǎng)。取活化后斜面酵母菌Y1一環(huán)，接種于500 mL液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h，備用。

2）產(chǎn)脂發(fā)酵。以10%接種量接入液體種子，100 mL搖瓶裝液量25 mL，160 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。

3）蘇丹黑B染色鏡檢。從培養(yǎng)平板挑取菌體涂片固定，用蘇丹黑B染色15 min，二甲苯?jīng)_洗，洗脫無(wú)色后再用番紅復(fù)染，水洗，吸干后顯微鏡觀(guān)察，菌體內(nèi)脂肪顆粒呈藍(lán)黑色。

4）油脂提取。每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴3 min，-20℃速冷，加入10 mL氯仿∶甲醇（1∶1），充分振蕩后，4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知質(zhì)量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮發(fā)除去氯仿層，稱(chēng)重，計(jì)算油脂產(chǎn)量（g/L）和菌體含油量（油脂得率），計(jì)算公式如下：

油脂產(chǎn)量=油脂質(zhì)量/所用發(fā)酵液體積

油脂得率=油脂質(zhì)量/干菌體質(zhì)量×100%

1.2.2 紫外誘變處理菌懸液的制備 挑取已活化的斜面菌種1環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。吸取培養(yǎng)液于無(wú)菌離心管中，5 000 r/min離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗滌2～3次，并稀釋為細(xì)胞濃度106個(gè)/mL，得菌懸液備用。

1.2.3 出發(fā)菌株最佳誘變時(shí)間的確定 取1 mL菌懸液于直徑60 cm培養(yǎng)皿中，開(kāi)啟紫外燈（25 W），照射距離36 cm，開(kāi)蓋進(jìn)行紫外線(xiàn)照射，分別照射10、30、50、70、90 s后加蓋，無(wú)菌條件下取0.1 mL照射后菌懸液在固體培養(yǎng)基中涂平板，用黑布包裹培養(yǎng)皿后，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。紫外輻照處理后，選擇酵母菌致死率為75%～80%時(shí)的照射時(shí)間為最佳誘變時(shí)間[7]。

1.2.4 高產(chǎn)菌株的篩選 對(duì)目檢出的各種形態(tài)的菌落進(jìn)行初篩和復(fù)篩以選出高產(chǎn)菌株。

初篩：從平板上長(zhǎng)出的菌落中，挑取出直徑較大、光澤度好、顏色鮮紅、質(zhì)地黏稠的單菌落，移至斜面，保藏。蘇丹黑染色后鏡檢出脂肪粒大且多的菌落，同時(shí)將該菌保存于斜面培養(yǎng)基。對(duì)培養(yǎng)皿和將要涂片的菌落進(jìn)行一對(duì)一標(biāo)號(hào)。

復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，將脂肪粒大的菌落的斜面以3環(huán)的接種量接入100 mL產(chǎn)脂培養(yǎng)基，于30 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)4 d[8]，檢測(cè)其生物量、油脂產(chǎn)量，篩選出生物量和油脂產(chǎn)量均較高的菌株。

1.2.5 菌體生物量的測(cè)定 取50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液置于100 mL離心管內(nèi)，4 500 r/min離心10 min，收集菌體并在65 ℃下干燥至衡重，準(zhǔn)確稱(chēng)取干菌體質(zhì)量，計(jì)算公式如下：

菌體生物量=干菌體質(zhì)量/發(fā)酵液體積

1.2.6 菌體油脂的提取 每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿∶甲醇（1∶1），充分振蕩后，4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知質(zhì)量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮發(fā)除去氯仿層，稱(chēng)重計(jì)算油脂產(chǎn)量和菌體含油量。

1.2.7 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將復(fù)篩的菌株接種至斜面培養(yǎng)基，連續(xù)傳代6次，搖瓶發(fā)酵后測(cè)其油脂產(chǎn)量，若油脂產(chǎn)量無(wú)顯著變化，說(shuō)明其遺傳性狀穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌株含油量

經(jīng)蘇丹黑B染色后，顯微鏡下可見(jiàn)初始菌株Y1菌體內(nèi)含有一定數(shù)量的呈黑綠色脂肪顆粒，經(jīng)測(cè)定此菌株含油量為9.6%，油脂產(chǎn)量為2.11 g/L，菌體油脂呈深綠色。有資料顯示，含油量在20%左右的產(chǎn)油菌株即具有潛在的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)價(jià)值[1]，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)旨在提高該菌株的油脂產(chǎn)量和含油率，使其能夠成為具有生產(chǎn)開(kāi)發(fā)價(jià)值的產(chǎn)油菌株。

2.2 紫外誘變的最佳誘變時(shí)間

通過(guò)不同時(shí)間梯度的紫外誘變后，其菌體致死情況見(jiàn)表1，選擇酵母菌致死率為75%～80%時(shí)的照射時(shí)間為最佳誘變時(shí)間[7]。由表1可知，該菌株的最佳紫外誘變時(shí)間為50 s。

2.3 紫外誘變初篩結(jié)果

蘇丹黑染色后鏡檢出脂肪粒大且多的菌落，以染色程度的深淺作為初篩的指標(biāo)進(jìn)行篩選。由表2可知，經(jīng)初篩后通過(guò)染色程度挑選出Y2、Y8、Y9、Y12、Y17菌株進(jìn)行復(fù)篩。

2.4 紫外誘變復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的Y2、Y8、Y9、Y12、Y17菌株分別以3環(huán)的接種量接入100 mL產(chǎn)脂培養(yǎng)基，其復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，Y9的油脂產(chǎn)量最高，為5.25 g/L。

2.5 紫外誘變遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將復(fù)篩后的突變株Y9接種固體斜面連續(xù)傳代6次，分別測(cè)其油脂產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，突變株油脂產(chǎn)量無(wú)顯著變化，證明其遺傳性狀穩(wěn)定。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株酵母菌Y1的紫外誘變獲得一株突變菌株Y9，測(cè)得Y9的油脂產(chǎn)量為5.25 g/L，油脂含量為23.85%。與出發(fā)菌株Y1油脂產(chǎn)量2.11 g/L、含油量9.6%相比有較明顯提高，因此選取油脂產(chǎn)量較高的Y9作為后續(xù)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂研究的試驗(yàn)菌株。

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（責(zé)任編輯 龔 艷）