摘要：逆境脅迫是制約植物生長發(fā)育、影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因子，揭示植物應(yīng)答脅迫的分子機理一直是人們長期探索的重大課題。植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以系統(tǒng)揭示不同脅迫條件下植物蛋白質(zhì)的表達狀況，從而深入了解環(huán)境脅迫下植物的基因表達調(diào)控機制、植物響應(yīng)脅迫機理。簡要介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)，概述了其在植物逆境脅迫適應(yīng)機制研究中的應(yīng)用，并對蛋白質(zhì)組學(xué)在該領(lǐng)域的發(fā)展前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)；非生物脅迫；生物脅迫；雙向電泳；質(zhì)譜

中圖分類號：Q946.1；Q945.78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5403-06

隨著生命科學(xué)的日益發(fā)展，對基因功能的研究已不僅僅局限在核酸水平。蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。要深入了解生命的復(fù)雜活動，就需要從蛋白質(zhì)的整體水平上進行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)，本質(zhì)上是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于組織變化、細胞代謝等過程的整體而全面的認識[1]。近些年來，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速，并得到了廣泛的應(yīng)用，成為生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。

植物在生長發(fā)育過程中會遭遇高（低）溫、干旱、水澇和高鹽等非生物脅迫以及病原菌侵染和蟲害等生物脅迫。植物感受逆境信號后，可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白的表達，從而調(diào)整自身的生理狀態(tài)或形態(tài)來提高對逆境的耐受能力。在蛋白水平，對發(fā)生變化的蛋白質(zhì)進行定性和定量測定，探討植物在逆境脅迫條件下的調(diào)控機制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多種植物的研究中取得了一定的成果。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

過去，許多科學(xué)家都致力于蛋白質(zhì)組的大規(guī)模定性分析，而現(xiàn)在，如何系統(tǒng)地識別和定量一個蛋白質(zhì)組則是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要目的之一[2]。由于蛋白質(zhì)的濃度在很大程度上影響了其功能的實現(xiàn)，因此，對蛋白質(zhì)的相對和絕對濃度進行測量也就變得至關(guān)重要。目前，比較成熟的蛋白質(zhì)定量方法主要分為兩類，一類基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色，另一類基于質(zhì)譜檢測技術(shù)。

1.1 基于凝膠的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

雙向電泳（Two dimensional electrophoresis，2DE）技術(shù)是由O’Farrell于20世紀(jì)70年代建立的[3]，具有高分辨率的特點，通常能分辨出1 000～3 000個蛋白點[4]。該技術(shù)自誕生以來，一直在不斷改進和優(yōu)化。目前，應(yīng)用比較廣泛的雙向電泳技術(shù)主要是雙向熒光差異凝膠電泳（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。但雙向電泳本身也存在著一些弊端：試驗重復(fù)性差；對蛋白質(zhì)的分離受到蛋白豐度、等電點、相對分子質(zhì)量和疏水性等的限制；自動化程度低；操作起來費時費力等，這些都在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

1.2 基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可以分為兩大類：標(biāo)記定量技術(shù)（Labeling quantitation）和非標(biāo)記定量技術(shù)（Label-free quantitation）[2]。此外，標(biāo)記或非標(biāo)記的鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)策略也是基于質(zhì)譜技術(shù)的常用方法。

1.2.1 標(biāo)記定量技術(shù)

1.2.1.1 同位素代謝標(biāo)記法

同位素代謝標(biāo)記以同位素元素或同位素標(biāo)記氨基酸形式摻入到細胞培養(yǎng)基中，在細胞生長代謝過程中完成蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記。此方法的顯著優(yōu)點是蛋白質(zhì)在樣品制備的初期被標(biāo)記，由此減少了試驗操作造成的誤差，從而提高了準(zhǔn)確度。目前比較常用的方法包括15N體內(nèi)代謝標(biāo)記和細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）方法。

1）15N體內(nèi)代謝標(biāo)記法。采用含有15N（或14N）作為惟一氮源的培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織（植株），依靠摻入合成蛋白質(zhì)的15N實現(xiàn)定量[5]。這項技術(shù)適用于多種蛋白提取物的蛋白質(zhì)定量，包括那些需要進行大量純化步驟、蛋白產(chǎn)量易發(fā)生改變的[6]。其優(yōu)勢還在于可應(yīng)用于水培植物，使得植物對養(yǎng)分的吸收得到更好的控制。

2）SILAC方法。依靠在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸（如賴氨酸或精氨酸等）實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定量，已經(jīng)廣泛用于高等動物細胞蛋白質(zhì)的鑒定及定量[5]。SILAC法標(biāo)記效率高、損失??；標(biāo)記誤差低，可靠性高。然而，由于植物細胞本身可以合成這些必需氨基酸，導(dǎo)致只有部分蛋白質(zhì)被標(biāo)記。并且，此方法成本較高，導(dǎo)致其在植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用受到了一定的限制。

1.2.1.2 同位素化學(xué)標(biāo)記法

1）同位素親和標(biāo)記法。比較典型且已商業(yè)化的一項技術(shù)是同位素親和標(biāo)記技術(shù)（Isotope coded affinity tages，ICAT）。ICAT 無需繁冗的雙向凝膠電泳技術(shù)，標(biāo)記策略靈活多變，可對低豐度、難溶性蛋白進行分析。近些年來，該技術(shù)與不同的質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用得到了廣泛的研究。但ICAT適用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修飾的蛋白質(zhì)。

2）酶催化18O-同位素標(biāo)記法。酶催化18O-同位素標(biāo)記法是通過加入H218O，在蛋白酶催化作用下將羧基上的2個16O替換成18O，從而對肽段進行標(biāo)記。該技術(shù)有以下優(yōu)點：操作簡單；標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確率高；應(yīng)用范圍廣，可用于多種不同類型的蛋白質(zhì)；可標(biāo)記所有酶解的肽段，使相對定量所有的蛋白質(zhì)成為可能；反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少；便于與磷酸化肽段富集方法聯(lián)用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標(biāo)記肽段；在蛋白質(zhì)水解分裂的同時被標(biāo)記上，避免了人為因素的干擾。但由于標(biāo)記后的蛋白質(zhì)樣品過于復(fù)雜，該技術(shù)還有待進一步的完善。

3）相對和絕對定量同位素標(biāo)記法。相對和絕對定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在 2004 年推出的一項新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)[7]。該技術(shù)使用8種（或4種）不同的同位素試劑來同時標(biāo)記和比較8種（或4種）不同的蛋白質(zhì)樣品。如今該技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，其優(yōu)越性也逐步在許多生物體和組織研究中得到了證明，已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法中一個十分重要的技術(shù)。

iTRAQ技術(shù)有如下特點：①樣本量大?？蓪Χ噙_4個樣本同時相對量化，大大降低了試驗過程中所引入的技術(shù)誤差；②定性分析結(jié)果可靠?？梢酝瑫r給出每一個組分的相對分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；③靈敏度、準(zhǔn)確度高。將離子抑制效應(yīng)、背景噪音和儀器條件等系統(tǒng)誤差的影響降到最小，獲得的變異系數(shù)在9%的范圍；④分離能力強，分析范圍廣。作為標(biāo)記的反應(yīng)不在活細胞，適合任何類型的蛋白質(zhì)樣品，包括高相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)、不溶性蛋白質(zhì)（eg.膜蛋白）等；⑤分析時間快，自動化程度高。

當(dāng)然，iTRAQ標(biāo)記技術(shù)也有自己的局限性。對全組蛋白質(zhì)而言，它只能對相對豐度進行比較，因此只能提供相對的定量；數(shù)據(jù)的復(fù)雜度更高，因此需要開發(fā)更多的信息學(xué)工具；高豐度蛋白質(zhì)干涉了低豐度蛋白質(zhì)的檢測和鑒定；每次試驗，研究人員都必須鑒別全部的蛋白質(zhì)組[8]。

1.2.2 非標(biāo)記定量技術(shù) 非標(biāo)記定量法（Label-free）是一種新興的蛋白質(zhì)定量方法，包括基于色譜峰面積定量法及利用二級離子信號的強度進行MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）檢測等。與標(biāo)記定量法相比，非標(biāo)記定量法不需要花費大量時間準(zhǔn)備同位素化合物，也不需要使用非常昂貴的試劑，但該技術(shù)比較依賴于儀器的狀態(tài)、樣品的復(fù)雜性以及一些未知因素，其靈敏度和精確度都不及標(biāo)記定量法。要得到廣泛的應(yīng)用，非標(biāo)記定量技術(shù)還需要進一步的優(yōu)化和改進。

1.2.3 鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)策略 鳥槍法首先采用標(biāo)記或非標(biāo)記的方法將蛋白質(zhì)混合物降解成肽段的混合物，利用質(zhì)譜進行分析測序，然后利用計算機技術(shù)描繪出肽段在蛋白質(zhì)上的位置圖譜，從而確定該混合物中的蛋白質(zhì)成分。其代表方法是MudPIT。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在植物逆境生物學(xué)研究中的應(yīng)用

自然界中有多種非生物和生物因子都會對植物的生長發(fā)育造成不利影響，嚴重時甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡。植物對這些逆境脅迫都有很強的響應(yīng)機制，可通過一系列從細胞到生理水平的應(yīng)答反應(yīng)來適應(yīng)這些不利的環(huán)境條件。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在逆境脅迫下植物蛋白質(zhì)種類及表達量的變化，將有助于人們從整體和動態(tài)的蛋白質(zhì)水平了解脅迫因子的傷害機制以及植物的適應(yīng)機制。

2.1 非生物脅迫的植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2.1.1 溫度脅迫 溫度是影響植物生長發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因子。目前的研究較多集中于溫度脅迫下差異表達蛋白質(zhì)的鑒定和植物響應(yīng)高溫、低溫分子機制的解析。

Ganmulla等[9]將24日齡水稻秧苗的葉片分別在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低溫和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高溫環(huán)境下處理3 d，并檢測其蛋白質(zhì)組變化。采用無標(biāo)記的鳥槍法，對每個處理組的3個生物學(xué)重復(fù)進行了蛋白質(zhì)定量分析。結(jié)果表明，在一個或多個處理組中被鑒定出來的蛋白，有超過400個都對溫度脅迫進行了響應(yīng)。其中，分別有43、126和47個蛋白專一地出現(xiàn)在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）處理組中。并且，與其他溫度處理相比， 12 ℃（20 d）處理后的水稻葉片蛋白質(zhì)組發(fā)生的變化更顯著。另外，該試驗還鑒定出了20個新的脅迫響應(yīng)蛋白。

為了檢測在成熟的硬質(zhì)小麥子粒中熱脅迫對非醇溶谷蛋白積累所產(chǎn)生的影響，Laino等[10]將意大利栽培種Svevo進行了2個不同的溫度處理（熱脅迫和對照）。通過檢測非醇溶谷蛋白的2-D模型，鑒定出了在灌漿期受熱脅迫影響的多肽。這項研究共發(fā)現(xiàn)了132個表達發(fā)生變化的多肽，其中有47個（包括HSPs和脅迫相關(guān)蛋白）是通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）和基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF-MS）鑒定出來的。很多熱誘導(dǎo)的多肽被認為會引起敏感植株的反應(yīng)。

2.1.2 水分脅迫 近年來，研究人員利用蛋白質(zhì)組學(xué)，已鑒定出一些水分脅迫響應(yīng)關(guān)鍵因子，并揭示出植物應(yīng)答水分脅迫所涉及到的多個代謝通路。

Ford等[11]在2011年首次采用鳥槍蛋白質(zhì)組策略研究了小麥（Triticum aestivum L.）栽培種在干旱脅迫下的蛋白豐度變化。對不耐旱種Kukri、耐旱種Excalibur和耐旱種RAC875在溫室中進行周期性干旱處理，處理結(jié)束后從葉片中提取蛋白，共鑒定出5 125個肽段，并分析出1 299個蛋白。從中選擇了159個在所有時間點都有表達的蛋白用iTRAQ技術(shù)進行相對定量。在不同時間點，3個栽培種的蛋白組變化反映了它們對干旱脅迫的不同生理響應(yīng)。結(jié)果顯示，在脅迫處理前期，Excalibur沒有明顯的蛋白組變化，而RAC875的蛋白組發(fā)生了顯著變化。這3個栽培種的蛋白組變化都與它們的氧化脅迫代謝和活性氧清除能力相一致，表現(xiàn)為超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的增多以及參與光合作用和卡爾文循環(huán)的蛋白的減少。

祁建民等[12]以鑒定出的耐旱性紅麻品種GA42為材料，在5葉期設(shè)置正常供水與控水比較試驗，運用雙向電泳分析紅麻在干旱脅迫和正常供水條件下葉片蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化。在干旱脅迫下出現(xiàn)65個差異表達蛋白質(zhì)點，選擇表達量明顯上調(diào)的9 個蛋白質(zhì)點，通過MALDI-TOF-TOF MS分析和數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出6個差異表達蛋白，分別是2個核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或其大亞基、1個Rubisco活化酶、1個二甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶、1個推測的胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶以及1個ATP合酶β亞基。試驗證明，紅麻GA42表現(xiàn)出較強的耐旱性與上述6個差異表達蛋白質(zhì)點明顯上調(diào)有關(guān)。

Komatsu等[13]將發(fā)芽2 d的大豆在水澇脅迫下處理2 d，從大豆的根系和下胚軸中提取蛋白質(zhì)。經(jīng)SD-PAGE和CBB染色后，在每張凝膠上得到具有可重復(fù)性的蛋白點約803個。水澇脅迫引起了21個蛋白點的表達量升高，其中有定位/貯存相關(guān)蛋白（11個）、能量相關(guān)蛋白（3個）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（2個）、初生代謝相關(guān)蛋白（2個）、細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白（1個）、病害/防御相關(guān)蛋白（1個）以及轉(zhuǎn)運蛋白（1個）。同時，7個蛋白點的表達量在水澇脅迫處理后降低，包括4個定位/貯存相關(guān)蛋白和3個病害/防御相關(guān)蛋白。

2.1.3 鹽脅迫及滲透脅迫 土壤鹽分過多是影響植物生長發(fā)育、導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的主要因素之一。鹽脅迫對植物的危害主要體現(xiàn)在滲透脅迫和離子脅迫等方面。

Barkla等[14]對植物質(zhì)膜在鹽脅迫下的作用進行了研究，鑒定出了參與調(diào)控液泡中Na+隔離的蛋白質(zhì)。對鹽脅迫處理的冰葉日中花和對照進行的雙向差異凝膠電泳分析表明，質(zhì)膜包括質(zhì)膜H+-ATPase 和V-ATPase的亞基，都與醛縮酶和烯醇酶這兩個糖降解酶相關(guān)。利用免疫共沉淀證實糖降解酶與V-ATPase的B亞基VHA-B存在相互作用。體外試驗證明，醛縮酶可以通過吸引ATP來激活V-ATPase的活性。采用擬南芥烯醇酶突變體進行生物學(xué)功能驗證，發(fā)現(xiàn)這些突變體對鹽脅迫敏感，并且在其質(zhì)膜中，醛縮酶激活V-ATPase水解活性的能力減弱。糖降解蛋白與質(zhì)膜的這些聯(lián)系直接上調(diào)了質(zhì)子泵的活性。

Bandehagh等[15]對油菜鹽脅迫響應(yīng)機制進行了研究，分析了耐鹽的油菜栽培種Hyola 308和不耐鹽的栽培種Sarigol的第二片新葉和第三片新葉中蛋白的表達。對處于營養(yǎng)生長期的植株分別進行0、175和350 mmol/L的NaCl處理。與第二片新葉相比，第三片新葉中的Na含量較高且生長勢較弱。不耐鹽植株中Na的積累比耐鹽的植株中更加顯著。2-DE凝膠檢測出了900多個蛋白點，其中有44個和31個蛋白的表達量分別在耐鹽和不耐鹽的基因型中發(fā)生了變化。聚類分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)第二片新葉的鹽含量可明顯區(qū)分出這兩種不同的基因型。MS分析鑒定出了46個蛋白，包括參與氧脅迫響應(yīng)、能量供應(yīng)、電子轉(zhuǎn)運、翻譯和光合作用的蛋白。

Skirycz等[16]研究了擬南芥葉片在緩和而持久的滲透脅迫下的適應(yīng)能力。通過15N代謝標(biāo)記法分析了蛋白變化。結(jié)果表明，質(zhì)體的ATPase、卡爾文循環(huán)和光呼吸都被下調(diào)了，但線粒體的ATP系統(tǒng)被上調(diào)了。這說明線粒體在植物遭受水分脅迫時對保護質(zhì)體起到很重要的作用。此外，脅迫下的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)非常一致，但很多蛋白與蛋白合成和降解相關(guān)，推測其受到了轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

張恒[17]用不同濃度的Na2CO3對星星草（Puccinellia tenuiflora）進行處理，研究了其在鹽脅迫下的應(yīng)答機制。應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記法對蛋白質(zhì)組進行定量分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體中68種Na2CO3應(yīng)答蛋白質(zhì)，它們主要參與捕光復(fù)合體、光系統(tǒng)Ⅱ、光合電子傳遞鏈和光系統(tǒng)Ⅰ的形成、能量代謝、卡爾文循環(huán)、光合色素代謝、基礎(chǔ)代謝、脅迫防御、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成與命運，以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。

2.1.4 營養(yǎng)脅迫 為了解水稻對磷缺乏的適應(yīng)性，Torabi等[18]分析了親本株系Nipponbare與其近等基因系NIL6-4（在第12條染色體上攜帶一個主要磷吸收的QTL）的根系在1和100 mmol/L磷濃度下生長的蛋白質(zhì)組。2-DE檢測到669個蛋白點，兩種基因型中有32個蛋白有明顯差異。其中，兩種基因型在脅迫條件下有17個蛋白表現(xiàn)不同。質(zhì)譜鑒定出參與適應(yīng)磷缺乏途徑的26個蛋白，包括活性氧清除劑、檸檬酸循環(huán)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物防御反應(yīng)蛋白，還有一些未知功能蛋白。這說明不僅有一條控制適應(yīng)磷缺乏能力的信號途徑，可能還存在著不同途徑間的相互作用。

Visioli等[19]對黑楊的一個高度抗鈣脅迫的未定種進行了蛋白組變化分析。運用2-D液相色譜技術(shù)分離出126個蛋白。其中，有20個蛋白被鑒定為受到了鈣脅迫的影響，并通過MALDI-TOF進行了指紋圖譜分析。在脅迫處理的樣品中，豐度較高的蛋白集中在葉綠體和線粒體中，說明這兩個細胞器在植物對鈣脅迫的響應(yīng)中扮演了重要角色。

李坤朋[20]對兩種不同基因型的玉米在富磷或缺磷條件下的蛋白質(zhì)組變化進行了雙向凝膠電泳分析，分別鑒定出79個和108個差異表達蛋白，功能解析表明，這些蛋白可能在調(diào)控玉米根系形態(tài)發(fā)育、細胞周期以及感知環(huán)境磷濃度變化等方面發(fā)揮了重要作用。

2.1.5 其他非生物脅迫 其他非生物脅迫如臭氧、重金屬、機械損傷等對植物的影響，也在蛋白質(zhì)組水平上取得了一定的進展。

肖清鐵等[21]以抗鎘水稻品種PI312777和鎘敏感水稻品種IR24為材料，在不同鎘離子濃度的條件下水培處理7 d。與對照相比，不同濃度鎘脅迫下，PI312777中熱激蛋白、谷胱甘肽還原酶、蛋白酶體α亞基6型、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶、硫氧還蛋白和DNA重組修復(fù)蛋白均上調(diào)表達；而IR24中熱激蛋白、谷胱甘肽還原酶、蛋白酶體α亞基6型的表達無顯著差異，但果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和硫氧還蛋白表達下調(diào)。此外，DNA重組修復(fù)蛋白僅在鎘脅迫的PI312777葉片中表達。這些差異表達的蛋白質(zhì)很可能是水稻PI312777比IR24具有更強鎘抗性的生物學(xué)基礎(chǔ)。

Fuhrs等[22]研究了豇豆蛋白質(zhì)組對錳脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)錳脅迫后豇豆葉綠體中與CO2固定和光合作用相關(guān)的蛋白豐度下降，說明錳脅迫對豇豆的能量代謝產(chǎn)生抑制作用。

樂寅婷等[23]對比了油菜（Brassica napus cv. Westar）在機械損傷前后可溶性總蛋白的含量變化，發(fā)現(xiàn)損傷后蛋白表達量增高。雙向凝膠電泳分析表明有8個蛋白質(zhì)點發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)，質(zhì)譜鑒定出Rubisco小亞基前體、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和糞卟啉-3-氧化酶，這些蛋白質(zhì)可能在油菜葉片應(yīng)答機械損傷過程中起關(guān)鍵作用。

Ahsan等[24]用雙向凝膠電泳法檢測了在O3脅迫下大豆中蛋白質(zhì)的變化，分別在葉片和葉綠體中鑒定出20個和32個差異表達蛋白。其中，參與光合作用（包括光系統(tǒng)Ⅰ/Ⅱ和碳素同化）的蛋白都在脅迫后表達量降低，而與抗氧化劑系統(tǒng)和碳代謝相關(guān)的蛋白表達量增高。參與糖代謝的酶活性在脅迫后增強，淀粉減少而蔗糖增加。試驗表明在光合系統(tǒng)經(jīng)受O3脅迫時，可能通過淀粉降解為三羧酸的循環(huán)功能，使碳分配受到了影響。

2.2 生物脅迫的植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2.2.1 病原菌侵染 病原菌侵染時植物局部會發(fā)生壞死并誘導(dǎo)產(chǎn)生一些抗病蛋白質(zhì)。

Maserti等[25]以柑橘屬（Citrus L.）的果樹為材料，對二斑葉螨（Tetranychus urticae）侵染后和茉莉酸甲酯處理后的葉片進行了蛋白表達差異分析，分別檢測出了110個和67個蛋白質(zhì)點。應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出50個蛋白，大部分都屬于光合和代謝相關(guān)蛋白。其中有5個與氧脅迫相關(guān)的酶，包括磷脂谷胱甘肽過氧化物酶、1個鹽脅迫相關(guān)蛋白、抗壞血酸過氧化物酶和錳超氧化物歧化酶。有7個防御相關(guān)蛋白，包括與發(fā)病相關(guān)的酸性幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑類奇蛋白和低密度脂蛋白等。

采用雙向電泳聯(lián)用 MOLDI-TOF-TOF 質(zhì)譜技術(shù)，張曉婷等[26]對水稻感病品種武育粳3號和抗病品種KT95-418感染水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）前后的葉片進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，RSV基因組編碼的病害特異蛋白（Disease specific protein， DSP）在武育粳3號中的積累量明顯高于KT95-418中。另外還鑒定出其他25個蛋白，包括RSV NS2蛋白，寄主中與光合作用、細胞氧化還原狀態(tài)和離子平衡狀態(tài)及蛋白的合成、轉(zhuǎn)運與翻譯后修飾等相關(guān)的蛋白。

鐘云[27]選用廣東主栽砧木資源——江西紅橘的根系為材料，運用iTRAQ技術(shù)，分析了其接種黃龍病病原后第50天的根系蛋白。鑒定得到差異顯著蛋白78個。差異蛋白主要參與生物代謝、防御反應(yīng)、抗氧化、轉(zhuǎn)運和幾丁質(zhì)代謝等。與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)性強的差異蛋白有36個，其中半數(shù)與抗病（逆）相關(guān)。植株感病后韌皮部篩管閉塞有關(guān)的篩管阻塞蛋白上調(diào)了1.67倍，這與防御黃龍病病原有關(guān)。另外，枯草桿菌樣蛋白酶表達是對照的282.09倍，說明該酶參與了黃龍病病原菌的抵御及根尖分生區(qū)的保護。

2.2.2 蟲害 魏哲[28]利用iTRAQ技術(shù)篩選了水稻抗褐飛虱相關(guān)蛋白質(zhì)。在褐飛虱取食96 h后的水稻葉鞘中，發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)表達量發(fā)生了顯著變化。這些蛋白包括3個JA合成蛋白質(zhì)（alpah-DOX、AOS和AOC），7個氧脅迫應(yīng)答蛋白（CATA、APX2和5個POXs），3個β-葡聚糖酶（Gnsl、Gns4和Gns5），3個蛋白激酶（CRKS、CRK6和atypicalRLK），1個蛋白網(wǎng)格蛋白，1個甘氨酸分解系統(tǒng)H蛋白，5個光合作用相關(guān)蛋白和4個水通道蛋白。其中AOC、CATA、3個POXs、Gnsl、Gns5、3個蛋白激酶和網(wǎng)格蛋白更多地在易感性水稻株系中被誘導(dǎo)。

由于自然環(huán)境下植物時常遭遇多重逆境，因此，目前有不少針對植物逆境蛋白質(zhì)組學(xué)的工作已不僅僅局限于單一脅迫，而是將相關(guān)性較高的幾種脅迫進行整合研究。Zhang等[29]對云南假虎刺（Carissa spinarum）同時進行了42 ℃高溫和干旱處理。在處理期和恢復(fù)期設(shè)置4個不同的時間點取葉片進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)49個蛋白質(zhì)點的表達量發(fā)生了變化。用MS和2-D凝膠法鑒定出30個蛋白，這些蛋白包括HSP、光合成相關(guān)蛋白、RNA加工蛋白以及參與代謝機制和能量生產(chǎn)的蛋白。Evers等[30]對馬鈴薯分別進行了冷脅迫和鹽脅迫處理，并在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)組水平都進行了分析和研究。發(fā)現(xiàn)響應(yīng)鹽脅迫和冷脅迫的基因和蛋白有一致也有不同。在蛋白質(zhì)組水平，大部分鑒定出的蛋白都在脅迫下表達增強了。大多數(shù)光合成相關(guān)蛋白的豐度在兩種脅迫下都降低了。

3 展望

綜上所述，作為后基因時代的一個重要研究手段，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在植物抗逆研究中廣泛開展，獲得了豐碩的成果，對傳統(tǒng)的植物生理學(xué)及功能基因組學(xué)研究進行了補充。然而，植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)是一個非常復(fù)雜的過程，人們對植物在逆境下產(chǎn)生的復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)都還知之甚少，在這方面的研究還處于初步階段。隨著越來越多植物全基因組測序的完成、EST數(shù)據(jù)庫的日益豐富，以及研究手段的不斷改進，相信將會有更多的與抗性相關(guān)的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物抗逆性的本質(zhì)，為植物抗脅迫品種的選擇和培育奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 潘 峰）