摘要：以毛地錢（Dumortiera hirsuta）為外類群，利用ClustalX 2.0和MEGA 4.1軟件對13種苔蘚植物的trnH-PsbA基因序列進行比對和分析，構建分子系統(tǒng)樹。結果表明，13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列長度為174～186 bp，排序后總長度為191 bp，其中變異位點51個，信息位點30個。遺傳距離在0.006～0.200，平均遺傳距離為0.103。利用非加權組平均數(shù)UPGMA（Unweight pair group method with arithmetic mean）法建立的系統(tǒng)樹顯示，13種苔蘚植物分為3組。在科間水平上，序列分析結果與形態(tài)學結果一致，trnH-PsbA序列對于苔蘚植物的系統(tǒng)發(fā)育研究有一定的參考價值。

關鍵詞：苔蘚；DNA條形碼；trnH-PsbA；親緣關系；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5057-03

The Phylogenetic Relationship of Some Bryophytes Based on trnH-PsbA Gene

LIU Ying1，ZHANG An-shi1，ZHAO Li-xin2

（1. Department of Biology， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454003， Henan， China；

2. Jiaozuo National Foresty Plant of Henan Province， Jiaozuo 454191，Henan， China）

Abstract： Using Dumortiera hirsuta as the outgroup， trnH-PsbA genes belonging to 13 bryophyte species were analyzed and aligned to construct the phylogenetic trees using ClustalX 2.0 and MEGA 4.1 softwares. The results showed that the length of trnH-PsbA gene in 13 bryophytes were between 174 bp and 186 bp. The total length of sequence was 191 bp after alignment， including 51 variable sites and 30 informative sites. The genetic distance were between 0.006 and 0.200， with the average of 0.103. 13 species in the UPGMA tree（Unweight pair group method with arithmetic mean tree） were clustered into three groups. The constructed phylogenetic trees based on sequences were consistent with the results based on morphology among families. It is proved that trnH-PsbA sequence is useful for studying phylogenetics of bryophytes.

Key words： bryophyte； DNA barcoding； trnH-PsbA； phylogenetic relationship； phylogenetic development analysis

2003年，加拿大學者Hebert等[1]利用線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COI） 中的一段650 bp序列，發(fā)現(xiàn)該基因序列在動物界不同分類水平上都具有良好的識別能力，從而提出了DNA條形碼（DNA barcoding）的概念，建立了一種新的物種鑒定技術[2]，為解決傳統(tǒng)分類學面臨的難題提供了新方法。由于線粒體COI基因在植物中的進化速率遠慢于動物，因此，很多學者認為植物的條形碼應從進化速率較快的葉綠體基因組中選擇[3，4]。

trnH-PsbA序列是進化速率最快的葉綠體間隔區(qū)之一，兩端存在75 bp的保守序列，便于引物的設計。作為植物DNA條形碼的候選片段，trnH-PsbA序列具有引物通用性較好、擴增成功率較高[5-8]等特點，并且平均長度較短，有利于對降解材料的擴增。本研究對13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列進行測序并分析，從DNA水平上探討它們的親緣關系，為苔蘚植物系統(tǒng)發(fā)育研究、苔蘚植物的數(shù)字化鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗材料除毛地錢（Dumortiera hirsuta）（作為外類群，GenBank序列號：HQ026394.1）外，均采自河南省云臺山世界地質公園（表1）。

1.2 PCR擴增及序列測定

采用改良CTAB法[9]提取苔蘚植物的基因組DNA。PCR引物為：PsbA-1f，5′- CTTGGCTCTTGCA

ACGATGA-3′； trnH-1r，5′-CCTCCCGCTTATTGATA

TGC-3′。PCR反應體積為35 μL，包括3 ng/μL DNA 2.8 μL、10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL、2×Taq Master Mix 17.5 μL；RNase-Free Water 10.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并送至金唯智生物科技（北京）有限公司純化后進行單向測序。

1.3 序列分析和系統(tǒng)樹構建

以毛地錢為外類群，將獲得的DNA序列用ClustalX 2.0軟件進行比對。用MEGA 4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。采用MP法和UPGMA法構建分子系統(tǒng)樹，以1 000次自舉分析（bootstrap）檢測各分支的置信度。

2 結果與分析

2.1 trnH-PsbA序列分析

測序結果顯示，13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列長度在174～186 bp，其中鱗葉蘚最長，為186 bp，狹葉擬合睫蘚最短，為174 bp，其余均在176～181 bp。包括外類群毛地錢在內的14種苔蘚植物的trnH-PsbA序列利用ClustalX 2.0對位排序時，將gap（空位）作missing（缺失）處理，排序后總長度為190 bp，其中變異位點118個，信息位點37個。去掉外類群，排序后總長度為191 bp，其中變異位點51個，信息位點30個。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

用Kimura-2-Parameter距離模式計算的遺傳距離表明，13種苔蘚植物的遺傳距離在0.006～0.200，平均遺傳距離為0.103。其中多枝青蘚與小石蘚最大，為0.200，彎葉青蘚與絨葉青蘚最小，為0.006。最大簡約樹的一致性指數(shù)CI為0.899 083，存留指數(shù)RI為0.838 235，存留一致性指數(shù)RCI為0.753 643。

利用UPGMA法構建分子系統(tǒng)樹表明（圖1），除外類群外，13種苔蘚植物形成兩個穩(wěn)定的分支。第一分支包含了7種叢蘚科苔蘚植物，其自展支持率為82%，第二分支包含了青蘚科和灰蘚科等6種苔蘚植物，其自展支持率為91%。其中青蘚科的絨葉青蘚、彎葉青蘚和多枝青蘚聚在一起，其自展支持率為98%；灰蘚科的金灰蘚、灰蘚凹葉變種和鱗葉蘚聚在一起，其自展支持率為62%，其分析結果與形態(tài)學結果一致。通過MP法構建的系統(tǒng)樹（圖2）與UPGMA法構建的系統(tǒng)樹略有差異，MP樹顯示，灰蘚科的3種苔蘚植物沒能完全聚類在一起，但兩大分支結構基本相同，因此，trnH-PsbA序列可用于苔蘚植物親緣關系的分析。

3 小結與討論

自從生物條形碼聯(lián)盟（CBOL）提出將trnH-PsbA序列作為植物DNA條形碼候選片段之后，trnH-PsbA已被廣泛地應用于植物的系統(tǒng)發(fā)育研究中[10-13]。本研究利用trnH-PsbA序列對13種苔蘚植物的擴增和測序的成功率均為100%，與有關研究有相似結果[14]。trnH-PsbA序列可以很好地支持13種苔蘚植物在科間水平上的親緣關系劃分。青蘚科和灰蘚科分別聚為一類，組成一支，叢蘚科組成另一支，完全符合形態(tài)學結果。但在叢蘚科苔蘚植物的科內劃分上與形態(tài)學結果有一定差異，如親緣關系較近的小石蘚和狹葉擬合睫蘚，以及高山大叢蘚云南變種和闊葉叢本蘚并未聚在一起。不同的建樹方法可能得到不同的效果，Lahaye等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)，MP樹和UPGMA樹得到的物種正確識別率最高。本研究發(fā)現(xiàn)通過UPGMA法構建的系統(tǒng)樹更能說明形態(tài)學結果。

由于不同序列的進化速率不同，可能導致不同序列間的分析結果有所不同，因此，隨著植物DNA條形碼研究的深入，科學家提出以多片段組合在不同分類階元上并進行綜合分析。Kress等[16]提出使用rbcL+matK+trnH-PsbA的片段組合構建超級矩陣來解決不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育關系。其中trnH-PsbA（即trnH-PsbA Ⅰ，trnH-PsbA Ⅱ，trnH-PsbA Ⅲ等）片段以目為單位進行歸類。本研究結果顯示，13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列分析結果在科間水平上與形態(tài)學結果一致，對于苔蘚植物的系統(tǒng)發(fā)育研究有一定的參考價值。

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