摘要：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以綠原酸為對照，分析物液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因子對通關(guān)藤（Marsdenia tenacissima）中總酚酸提取率的影響。結(jié)果表明，影響提取率的主次因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度，最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間1.0 h，料液比1∶16（m/V，g∶mL），提取溫度50 ℃。

關(guān)鍵詞：通關(guān)藤（Marsdenia tenacissima）；總酚酸；提取工藝

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5021-02

Technology of Extracting Total Phenolic Acid from Marsdenia tenacissima

MENG Heng-ling1，YANG Sheng-chao2，SU Yi-lan1，WEN Guo-song2

（1.The key laboratory of high quality crops cultivation and safety control，Honghe university， Honghe，661100，Yunnan，China；

2.Yunnan Agricultural University / Yunnan Provincial Good Agricultural Practice Center of Chinese Medical Materials，Kunming 650201，China）

Abstract： The orthogonal design was used to analysis optimize extraction process of total phenolic acid from Marsdenia tenacissima. Four factors including the material ratio， extracting time， extraction temperature and mass fraction of ethanol were sudied using chlorogenic acid as control. The results showed that the order of the four factors affecting extraction efficiency was as follows： mass fraction of ethanol > extraction time > material liquid ratio >extraction temperature. The optimal extraction process of chlorogenic acid was mass fraction of ethanol 70%， extracting time 1 h， material liquid ratio 1∶16， extraction temperature 50 ℃.

Key words： Marsdenia tenacissima； total phenolic acid； extraction process

通關(guān)藤（Marsdenia tenacissima）為蘿摩科牛奶菜屬植物，別名烏骨藤、大苦藤、扁藤、下奶藤等。主要分布于我國云南、廣西、貴州、四川等地及越南、老撾、緬甸等東南亞國家，具有清熱解毒、祛痰平喘、散結(jié)止痛的作用，用于氣管炎、支氣管哮喘等病的治療[1]。曾收載于《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》和《中國藥典》，具有免疫調(diào)節(jié)、保肝利尿、敗毒抗癌等作用，對胃癌、肝癌等多種腫瘤具有確切的抗腫瘤療效[2，3]。通關(guān)藤是一種重要的中藥材，以通關(guān)藤為單味藥制成注射液、糖漿、口服液、片劑、膠囊等多種劑型，含有甾體酯苷、生物堿、有機(jī)酸、多糖、樹脂及色素等多種化學(xué)成分[4]。通關(guān)藤中綠原酸含量較高，為有效成分之一[5]， 綠原酸有抗誘變、抗菌、抗病毒等作用，而多酚類物質(zhì)具有殺死癌細(xì)胞，使人肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞向正常細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的作用[6]。對綠原酸的提取方法進(jìn)行研究，可為制藥企業(yè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 粉碎機(jī)（美的）、HH-4型數(shù)字恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電子分析天平（BSA224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、紫外分光光度計(jì)（722S，上海箐華科技儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號110863-200905）；野生通關(guān)藤（紅河州金平縣）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確稱取10 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品放入棕色錐形瓶內(nèi)，量取100 mL 70%乙醇倒入錐形瓶內(nèi)，搖勻，制成0.1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取潔凈的10 mL容量瓶6個(gè)，分別精確量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6個(gè)容量瓶中，并用70%乙醇定容至刻度；以70%乙醇做空白對照，在327 nm最適吸收波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程■=39.537 x-0.016 4，相關(guān)系數(shù)r=0.995 5，相關(guān)性較好。

1.2.3 供試溶液的制備 分別稱取通關(guān)藤粉末5 g，放入具塞的錐形瓶內(nèi)，按1∶15、1∶16、1∶17（m/V，g∶mL，下同）料液比的配制條件加入相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇配制成供試液，并在相應(yīng)條件下進(jìn)行提取，提取液過濾后用相應(yīng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇定容至100 mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

將乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度4個(gè)影響通關(guān)藤中總酚酸提取效率的因素按四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1，表2），結(jié)果表明，各因素對通關(guān)藤中總酚酸提取效率影響的大小依次是乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度；最佳提取條件為A2B2C1D2，即料液比1∶16，提取溫度50 ℃、提取時(shí)間1.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

取同一份標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，重復(fù)檢測3次，分別測綠原酸的吸光度，結(jié)果表明，CV為0.19%，該方法精密度較好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取同一樣品，制備供試品溶液，分別放置2、4、6、18、30、32、34、36、38、40 h后，取1 mL供試液用70%的乙醇定容到50 mL然后測定其吸光度，每個(gè)樣品測定3次重復(fù)。結(jié)果表明，總酚酸提取液在34 h時(shí)穩(wěn)定性良好，CV為0.42%；36 h和38 h時(shí)，CV分別為6.6%和10.5%。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

分別吸取1 mL提取液，置于6個(gè)50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，測定其吸光度，每個(gè)樣品3次重復(fù)。結(jié)果表明，CV為1.85%，該試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

分別吸取1 mL最適條件下的總酚酸提取液于5個(gè)50 mL的容量瓶中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5 mL，再加入70%乙醇定容，搖勻，計(jì)算其平均回收率。結(jié)果表明，平均回收率為100.72%（n=5），CV為2.49%。

3 結(jié)論與討論

總酚酸提取液在34 h內(nèi)穩(wěn)定性最好，影響通關(guān)藤中總酚酸提取率因素主次順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度，即料液比為1∶16、提取溫度為50 ℃、提取時(shí)間為1.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個(gè)不穩(wěn)定部分。在從植物提取過程中，往往通過水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化，由于綠原酸本身的不穩(wěn)定性，提取時(shí)不能高溫、強(qiáng)光及長時(shí)間加熱。綠原酸的供試液應(yīng)避光、低溫保存時(shí)最為穩(wěn)定。本研究結(jié)果與向昌國等[7]對甘薯葉、莖中綠原酸提取研究所得到的最佳提取條件為50%乙醇或甲醇、浸提時(shí)間1.0～1.5 h、溫度40 ℃的結(jié)果基本一致。

綠原酸是有效的酚型抗氧化劑，其抗氧化活性強(qiáng)于咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、香豆酸等酚類物質(zhì)，具有降壓及抗腫瘤作用[8]。本研究在最適條件下提取的總酚酸含量為16.15 mg/g，提取率為1.62%，與徐佳佳等[9]對通關(guān)藤的研究結(jié)果一致，高于從福菊（2.93 mg/g）、杭菊（3.15 mg/g）[10]和北五加皮（0.63%）中提取的綠原酸的含量[11]。

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