中藥及復(fù)方水提物對(duì)DPPH·和·OH的清除作用

龔永歡，劉 霞，周海霞，李 偉，馬 林

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000）

摘要：采用分光光度法分析測(cè)定了具有抗仔豬腹瀉作用的12種中藥及5個(gè)復(fù)方的水提物對(duì)1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除能力，并對(duì)其多糖含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，12種中藥及5個(gè)復(fù)方對(duì)DPPH·和·OH均有一定程度的清除作用。濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，秦皮、白頭翁、黃連、黃柏以及復(fù)方2、4、5對(duì)DPPH·清除作用較好，在高濃度時(shí)與維生素C對(duì)DPPH·的清除作用相當(dāng)。除復(fù)方3外，中藥復(fù)方在高濃度時(shí)對(duì)DPPH·的清除率接近或高于其組成中藥，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。濃度在5～25 mg/mL范圍內(nèi)，白術(shù)、防風(fēng)、魚(yú)腥草及復(fù)方1和復(fù)方3對(duì)·OH的清除作用較好，復(fù)方1和復(fù)方3表現(xiàn)出對(duì)·OH清除的協(xié)同作用。中藥及其復(fù)方多糖含量與DPPH·和·OH清除作用不存在明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞： 抗腹瀉中藥；抗氧化；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基；羥基自由基

中圖分類號(hào)：R932 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）20-4995-05

Scavenging Effect of Aqueous Extracts from Some Anti-diarrhea Chinese Herbs and Compounds on DPPH· and ·OH

GONG Yong-huan，LIU Xia，ZHOU Hai-xia，LI Wei，MA Lin

（School of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621000， Sichuan， China）

Abstract： Using spectrophotometric and phenol-sulfuric acid method， the scavenging effect on DPPH and hydroxyl radicals， and the polysaccharide contents in the aqueous extracts from 12 Chinese herbs and 5 compounds with anti-diarrhea effects were investigated. The results showed that all 12 Chinese herbs and 5 compounds had scavenging effect on DPPH· and ·OH with different degree. With the concentration of 0.2 to 1.0 mg/mL， the Cortex fraxini， Radix pulsatillae， Rhizoma coptidis and Cortex phellodendri and the compounds 2， 4 and 5 had high scavenging effects on DPPH·. The scavenging effect was close to that of vitamin C at 0.8 mg/mL and 1.0 mg/mL. Except the compounds 3， other compounds had synergistic effect and showed higher scavenging effect on DPPH than that of its component herbs with tested concentration. Under the concentration of 5 mg/mL to 25 mg/mL， the extracts from Rhizoma atractylodis， Radix saposhnikoviae and Houttuynia cordata and compounds 1 and 3 had good scavenging effect on hydroxyl radicals. Similarly， the compounds 1 and 3 showed synergistic effect. There was no significant correlation between the polysaccharide content of different herbs， compounds and the scavenging effect on DPPH· and ·OH.

Key words： anti-diarrhea Chinese herbs； antioxidant； DPPH·； ·OH

早期斷奶仔豬因消化器官發(fā)育不充分、消化酶分泌不足、免疫力低下等極易帶來(lái)嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腸道系統(tǒng)紊亂及腹瀉[1]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，維持著機(jī)體的正常生理機(jī)能，但當(dāng)仔豬在遭受患病、應(yīng)激或者日糧中營(yíng)養(yǎng)缺乏等情況下，機(jī)體代謝出現(xiàn)異常，自由基將過(guò)量產(chǎn)生。自由基活性極高，攻擊性很強(qiáng)，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列變化，致使動(dòng)物病理狀況加重[2，3]。中國(guó)全年仔豬平均腹瀉發(fā)病率為46.5%[4]，因腹瀉死亡的仔豬占仔豬總數(shù)的39.8%[5]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)上多采用向日糧中添加一定量的抗生素來(lái)預(yù)防仔豬腹瀉，應(yīng)用抗生素雖帶來(lái)了良好的經(jīng)濟(jì)效益，但長(zhǎng)期、高劑量的使用會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性以及抗生素殘留，這些問(wèn)題已引起了廣泛爭(zhēng)議，限制使用或禁止使用抗生素添加劑已在歐盟、日韓等國(guó)開(kāi)始實(shí)施，尋找新的抗生素替代品已成為必然[6，7]。研究表明，無(wú)機(jī)元素、益生菌、益生素、有機(jī)酸、酶制劑、低聚糖、動(dòng)物血粉及中草藥制劑或這些抗生素替代品的聯(lián)合應(yīng)用，具有改善仔豬生長(zhǎng)性能、防治腹瀉、提高免疫等效應(yīng)，其中，中草藥以其具有的抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等功能，以及細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性、容易降解、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)更加受到重視[8-10]。

目前，關(guān)于仔豬抗腹瀉中藥的抗氧化研究大多為體外測(cè)定血液生化指標(biāo)，如血液中丙二醛含量、一些酶的活性或含量，而直接研究體外對(duì)自由基的清除影響則少有報(bào)道。馬玉芳等[11]向基礎(chǔ)日糧中按4 kg/t的量添加中藥飼料添加劑，發(fā)現(xiàn)血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的活性均較抗生素對(duì)照組高，而丙二醛的含量均比抗生素對(duì)照組低；張世昌[12]的研究結(jié)果表明，兩個(gè)中藥復(fù)方處理其谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量較對(duì)照組分別提高了26.14%和30.49%，處理組超氧化物歧化酶的含量也有所提高，而丙二醛的含量則明顯降低。中草藥及其制劑在生物機(jī)體內(nèi)清除自由基的作用機(jī)制雖復(fù)雜多變，但針對(duì)特定的自由基進(jìn)行體外研究條件易控、操作簡(jiǎn)便，有助于進(jìn)一步闡釋中草藥的抗氧化機(jī)制。本研究測(cè)定了具有抗腹瀉作用的12種中藥及5個(gè)復(fù)方的水提物對(duì)1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的體外清除作用，并分析了多糖含量與自由基清除作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），高速離心機(jī)（太倉(cāng)市科教器材廠），精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.1.2 試劑 DPPH（分析純，日本東京化成株式會(huì)社生產(chǎn)），抗壞血酸、水楊酸、雙氧水、硫酸亞鐵、葡萄糖和苯酚等均為分析純。

1.1.3 中藥材 黃連、刺五加、魚(yú)腥草、黃柏、陳皮、龍膽草、黃芪、甘草、白頭翁、白術(shù)、防風(fēng)、秦皮等12種中草藥材均購(gòu)自四川本草堂藥業(yè)有限公司，由綿陽(yáng)師范學(xué)院羅明華教授鑒定為正品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中藥水提物制備 供試材料為上述12種藥材及按適當(dāng)比例組配的5個(gè)復(fù)方（復(fù)方1：刺五加、黃芪、魚(yú)腥草及甘草；復(fù)方2：白頭翁、黃柏、陳皮及黃連；復(fù)方3：黃芪、白術(shù)及防風(fēng)；復(fù)方4：白頭翁、龍膽草及黃連；復(fù)方5：白頭翁、黃柏、黃連及秦皮）。12種中藥及5個(gè)復(fù)方分別粉碎過(guò)60目篩，55 ℃烘至恒重。分別取100 g中藥粉末，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸餾水，加熱提取2 h（急火加熱至沸，然后文火煎煮），離心。離心后的藥渣再按同樣方法提取2次。合并3次提取的離心上清液，濃縮至90 mL左右，定容為1 g生藥/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中藥對(duì)DPPH·的清除作用 參照許申鴻等[13]的方法，略加改動(dòng)。取0.1 mmol/L的DPPH溶液2～10 mL于試管中，再分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL 的各中藥水提物2 mL，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng) 30 min， 于517 nm處測(cè)定吸光度值。以維生素 C為對(duì)照，按同樣方法測(cè)定。

1.2.3 復(fù)方對(duì)·OH的清除作用 參照張強(qiáng)等[14]的方法作適當(dāng)修改。取10 mL試管，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液及9 mmol/L水楊酸溶液各1mL，再分別加入預(yù)先稀釋好的濃度為5、10、15、20和25 mg/mL中藥水提物，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動(dòng)反應(yīng)。置37 ℃水浴反應(yīng)30 min，在510 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，以維生素C為對(duì)照。

1.2.4 中藥水提物多糖含量測(cè)定 取濃度為1 g生藥/mL的12種中藥及復(fù)方的水提物各25 mL，加4倍體積95%的乙醇浸提6～8 h。真空抽濾，醇沉物用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌，得粗多糖，干燥至恒重。

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 mg/mL的葡萄糖溶液在490 nm波長(zhǎng)的吸光度值。

取制備的中藥粗多糖適量，用蒸餾水溶解配制成0.1～1.0 mg/mL濃度，按測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液方法操作，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 12種中藥對(duì)DPPH·的清除作用

根據(jù)12種中藥對(duì)DPPH·的清除率的相對(duì)高低，劃分為高清除率組、中等清除率組和低清除率組，結(jié)果見(jiàn)圖1。12種中藥在濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度增加，對(duì)DPPH·的清除能力均增強(qiáng)。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，秦皮、白頭翁、黃連清除作用較好，與維生素C的清除能力相接近，而白術(shù)和黃芪的清除效果相對(duì)較差，清除率不足40%，黃柏、刺五加、魚(yú)腥草、龍膽草、甘草、陳皮及防風(fēng)清除率在51%～84%。在濃度為0.2 mg/mL時(shí)，僅有秦皮具有較高的DPPH·清除能力（78%），其余中藥清除率范圍為10%～53%。

2.2 中藥復(fù)方對(duì)DPPH·的清除作用

由圖2可知，中藥復(fù)方濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度增加對(duì)DPPH·的清除作用增強(qiáng)，復(fù)方1、2、4和5清除作用明顯優(yōu)于復(fù)方3，其中復(fù)方5在各濃度時(shí)清除率都高于其他復(fù)方組。在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，復(fù)方1、2、4和5的清除能力與維生素C的清除能力相接近，復(fù)方3的清除率僅為19.6%；在濃度為0.2 mg/mL時(shí)，復(fù)方3對(duì)DPPH·幾乎沒(méi)有清除作用，其余復(fù)方清除率范圍為15%～43%。復(fù)方2、4及5清除率高可能與其中均含有白頭翁和黃連有關(guān)。將各復(fù)方與其組成成分進(jìn)行比較，除復(fù)方3外，其余中藥復(fù)方在0.8 mg/mL和1.0 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH·的清除作用接近或高于單一中藥，表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化效應(yīng)。

2.3 12種中藥對(duì)·OH的清除作用

由圖3可知，清除率相對(duì)較高的中藥包括白術(shù)、刺五加、防風(fēng)和魚(yú)腥草，清除率中等的中藥有白頭翁、黃芪、黃連和陳皮，清除率低的為龍膽草、甘草、秦皮和黃柏。中藥濃度在5～25 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度增加其對(duì)·OH的清除作用增強(qiáng)，其中白術(shù)、刺五加、防風(fēng)及魚(yú)腥草清除作用相對(duì)較高，秦皮和黃柏作用效果相對(duì)較差，隨著濃度增加，對(duì)·OH清除作用增長(zhǎng)幅度很小。在25 mg/mL時(shí)白術(shù)、刺五加、防風(fēng)及魚(yú)腥草清除率均高于60%，秦皮和黃柏清除率低于30%，其余中藥清除率在25%～58%；在5 mg/mL時(shí)，陳皮、黃柏的清除率不足5%，其余中藥清除作用效果也較差，總體在7%～28%范圍內(nèi)。

2.4 中藥復(fù)方對(duì)·OH 的清除作用

由圖4可知，復(fù)方1和復(fù)方3的清除作用優(yōu)于復(fù)方 2、4和5。在25 mg/mL時(shí)，復(fù)方1的清除率較高（67.68%），復(fù)方5的清除率較低（30.61%）；5 mg/mL 時(shí)復(fù)方3的清除率最高，為27.87%，復(fù)方2的清除率僅為8.51%。復(fù)方與其含有的單一中藥比較，復(fù)方1整體表現(xiàn)出很好的協(xié)同作用，復(fù)方3僅在5 mg/mL和10 mg/mL時(shí)清除率高于含有的單一中藥，而復(fù)方2、4及5清除率介于組成復(fù)方的單一中藥之間，清除作用較差。

2.5 中藥及其復(fù)方多糖含量與自由基清除作用的相關(guān)性

采用苯酚-硫酸法并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（A=14.773C-0.036 1，R2=0.997 9，在10～50 μg/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)）計(jì)算測(cè)得12種中藥及5個(gè)中藥復(fù)方多糖含量，以對(duì)DPPH·和·OH清除率分別達(dá)到50%和25%所需中藥提取液濃度（IC50或IC25）作為衡量清除自由基活性強(qiáng)弱的指標(biāo)（IC50或IC25值越小，清除作用越強(qiáng)），比較分析多糖含量與對(duì)自由基清除作用的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，12種中藥中白術(shù)多糖含量達(dá)36.40%，防風(fēng)、陳皮、黃柏、甘草的多糖含量為7.00%～14.93%，秦皮中多糖含量最低，為0.79%，其余中藥多糖含量為1.61%～4.08%；復(fù)方中復(fù)方3的多糖含量達(dá)31.46%，其余復(fù)方中多糖含量范圍為3.12%～6.00%。

12種中藥及復(fù)方中對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到50%所需濃度IC50值最小的為秦皮（0.02 mg/mL），白術(shù)、防風(fēng)、黃芪及復(fù)方3的IC50值均大于1.00 mg/mL，其余中藥及復(fù)方IC50值為0.22～0.82 mg/mL，12種中藥IC50與多糖含量有中度正相關(guān)性（r=0.524），中藥復(fù)方IC50與多糖含量低度正相關(guān)（r=0.400）；12種中藥及復(fù)方在濃度范圍內(nèi)對(duì)·OH 清除率不高，以清除率到達(dá)25%所需中藥濃度（IC25）表示其清除作用強(qiáng)弱。黃柏IC25值最大，其余中藥及復(fù)方IC25在4.744～28.493 mg/mL范圍內(nèi)。12種中藥及復(fù)方IC25與多糖含量基本不相關(guān)（r1=0.109，r2=-0.300）。

3 小結(jié)與討論

DPPH·是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，如果受試物能清除DPPH·，表明受試物具有清除氧自由基、烷自由基或阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的作用[16]。DPPH法已被廣泛用于評(píng)價(jià)受試物體外抗氧化活性，并且該方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好。本研究發(fā)現(xiàn)12種中藥中秦皮、白頭翁、黃連及黃柏對(duì)DPPH·清除作用較好，白術(shù)和黃芪清除作用較差；動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基95%以上都是氧自由基，·OH自由基作為最具代表性的氧自由基，極其活潑，反應(yīng)速率快 ，可損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等生物大分子[17]。本研究結(jié)果表明，白術(shù)、刺五加、防風(fēng)、魚(yú)腥草清除·OH效果相對(duì)較好，秦皮和黃柏作用效果相對(duì)較差。不同中藥對(duì)自由基的清除作用表現(xiàn)較大差異，趙駿等[18]研究的20種中藥水提液在4 mg/mL時(shí)對(duì)自由基的清除率為22.6%～94.1%，差異較大。

復(fù)方1、2、4和5對(duì)DPPH·清除作用較好，在1 mg/mL時(shí)清除作用與維生素C相接近，并且復(fù)方1、2、4和5在0.8、1.0 mg/mL時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化作用；復(fù)方1和3對(duì)·OH清除作用較好，復(fù)方1整體表現(xiàn)出很好的協(xié)同作用，復(fù)方3僅在5 mg/mL和10 mg/mL時(shí)表現(xiàn)一定程度的協(xié)同抗氧化作用。這些復(fù)方表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化效應(yīng)可能是復(fù)方中含有多種中藥多糖或與其他活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確[19，20]。

據(jù)報(bào)道，中藥抗氧化的主要活性成分有多糖類、黃酮類、酚類以及皂苷類化合物[21]。多糖類化合物對(duì)自由基的清除作用國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，Maity等[22]的報(bào)道表明蘑菇多糖對(duì)DPPH·有較好的清除作用，且對(duì)自由基的清除率隨多糖含量升高而增大。胡飛等[23]的研究也表明苦瓜多糖對(duì)DPPH·和超氧離子具有顯著清除作用，清除率與多糖呈正相關(guān)的量效關(guān)系。本研究同樣發(fā)現(xiàn)同一種中藥或復(fù)方對(duì)DPPH·和·OH的清除作用隨著水提物多糖含量升高而增大。然而，不同中藥或復(fù)方清除DPPH·作用與其多糖含量沒(méi)有明顯的相關(guān)性，即多糖含量高的中藥或復(fù)方并不具有較高的清除DPPH·能力，對(duì)·OH的清除作用也基本與多糖含量不相關(guān)。這可能是因?yàn)橹兴幎嗵谴嬖诮Y(jié)構(gòu)多樣性，不同多糖在組成及結(jié)構(gòu)上的不同可能導(dǎo)致對(duì)自由基清除作用的較大差異。

綜合分析，12種中藥及5個(gè)復(fù)方都有一定的清除DPPH·和·OH的能力，能有效地減少機(jī)體自由基氧化損傷。

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