摘要：以日光溫室多年生韭菜新世紀雪韭為試材，研究了土壤不同硫磺（S）施用量對韭菜硝酸鹽含量、氮代謝關鍵酶活性和葉綠素熒光動力學參數(shù)的調控效應。結果表明，隨著硫磺施用量的增加，韭菜葉片硝酸鹽含量呈先減少后增加的趨勢，當硫磺施用量為7.2 kg/hm2時硝酸鹽含量最低，較對照減少7.2%；韭菜產(chǎn)量、硝酸還原酶（NR）活性、PSII最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、電子傳遞速率（ETR）和葉綠素含量則表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，均以硫磺施用量7.2 kg/hm2時達到最大值，其中NR活性和ETR分別比對照提高了10.7%和25.8%；另外，谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT）活性隨硫磺施用量的增加呈逐漸增加的趨勢，硫磺施用量為54.0 kg/hm2時，GPT和GOT的活性達到最高，分別比對照增加了22.5%和9.4%。

關鍵詞：硫磺；韭菜；硝酸鹽累積；氮代謝關鍵酶

中圖分類號：S633.3；S147.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-4882-04

Effects of Sulphur Levels on Nitrate Accumulation and Nitrogen Metabolism Activities of Key Enzymes in the Leaves of Chinese Chive

XIE Xin1，DUAN Li-xiao2，WANG Jun-ling3，GAO Zhi-kui1

（1. College of Horticulture， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；2. Baoding Institute of Strawberries， Baoding 071000，Hebei，China；3. College of Life Sciences， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China）

Abstracts： The regulatory effects of soil concentration of sulfur processing on nitrate content， nitrogen metabolism activities of key enzymes and chlorophyll fluorescence parameters in the leaves of Chinese chive were studied in sunlight greenhouse. The results showed that the nitrate content first decreased and then increased with the increase in the sulfur concentration. When the sulfur concentration was 7.2 kg/hm2， the nitrate contend was the lowest and then decreased by 7.2% compared with the control. The production， nitrate reductase（NR） activity， PSII maximum quantum yield （Fv/Fm）， electron transport rate（ETR） and chlorophyll content of Chinese chive showed a decreasing trend after the first increase. The maximum was in sulfur concentration of 7.2 kg/hm2 comparing with the control. NRA and ETR increased 10.7% and 25.8%， respectively. In addition， glutamate pyruvate transaminase（GPT） and glutamate oxaloacetate transaminase（GOT） activity showed a gradual increase trend with the increase of S concentration. When concentration of S was 54.0 kg/hm2， GPT and GOT activity reached the highest level and increased by 22.5% and 9.4% comparing with the control.

Key words： Sulfur； Chinese chive； nitrate accumulation； nitrogen metabolism activities of key enzymes

蔬菜容易富集硝酸鹽[1]，其富集的過量硝酸鹽危害人體健康，且日益受到人們的關注，普遍認為蔬菜硝態(tài)氮吸收大于還原是產(chǎn)生硝酸鹽累積的根本原因[2，3]。為了限制硝態(tài)氮的吸收，目前國內(nèi)外的一些研究與生產(chǎn)中，以減控氮素供應量來調控[4]，雖然顯著降低了硝酸鹽的累積，但導致蔬菜不同程度的減產(chǎn)和品質的下降。

近年來，由于作物復種指數(shù)的提高，加之不含硫的高濃度肥料的普遍應用，使得越來越多的國家和地區(qū)出現(xiàn)了土壤缺硫情況[5-9]，缺S脅迫會阻礙N代謝及蛋白質的合成，引起植株體內(nèi)N中間產(chǎn)物（硝態(tài)、氨基態(tài)等）的積累，從而導致蛋白質含量的降低[10，11]。施硫可顯著降低土壤的pH，有利于減少土壤氨的揮發(fā)[12]，增加土壤含氮量，同時能有效抑制NH4+向NO3-的轉化[13]，從而降低硝酸鹽的累積，但降低程度和土壤中硫的施用量有關[14，15]。吳曦等[14]研究表明，土壤中施適宜的硫磺可明顯降低油菜體內(nèi)NO3--N含量，提高硝酸還原酶活性，硫磺用量過高時會抑制油菜的生長。過量施用硫磺會引起土壤中SO42-濃度過高，從而抑制植物根系對NO3-、HMoO4和H2BO3的吸收，誘發(fā)植株體內(nèi)硝酸還原酶的重要組分Mo和B的缺乏，降低植株體內(nèi)硝酸還原酶活性。因此，篩選土壤中的適宜硫施用量對降低硝酸鹽累積，提高蔬菜品質有著重要的意義。

本研究針對韭菜生產(chǎn)中硝酸鹽累積問題，基于氮-硫代謝的偶聯(lián)與相關平衡關系，分析不同施用量的硫磺對韭菜葉片硝酸鹽含量、氮代謝相關酶活性、葉綠素熒光參數(shù)的變化以及氮代謝產(chǎn)物的影響，篩選出降低韭菜硝酸鹽累積效果顯著的硫磺施用量，探討硫磺降低韭菜硝酸鹽累積的調控機制，為綠色蔬菜的栽培提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以多年生日光溫室韭菜新世紀雪韭為試材，試驗于2010年2月5日在河北農(nóng)業(yè)大學東校區(qū)日光溫室進行，農(nóng)藝管理按常規(guī)進行。采收前9 d采用硫磺（S）根施，設5個處理水平：0.0 kg/hm2（S0）、7.2 kg/hm2（S1）、18.0 kg/hm2（S2）、36.0 kg/hm2（S3）和54.0 kg/hm2（S4），每處理3次重復。于處理后第 9天進行韭菜生理生化指標的測定。

1.2 試驗方法

收獲時每個處理隨機抽取10株韭菜單株，測定地上部的鮮重，之后在105 ℃殺青10 min，再轉移到60 ℃烘干至恒重，測其干重。3次重復，取平均值。

硝酸鹽含量采用改進的紫外差減法測定[16]，硝酸還原酶（NR）活性采用分光光度法測定[17]，谷氨酰胺合成酶（GS）活性參照王月福等[18]的方法，谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT） 活性采用吳良歡等[19]的測定方法，葉綠素含量采用SPAD-502葉綠素計進行測定?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍G-250法測定[17]，游離氨基酸含量采用水合茚三酮法測定[17]，所有測定3次重復，數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行整理、分析和作圖。

葉綠素熒光參數(shù)的測定采用德國WALZ公司生產(chǎn)的調制式熒光成像系統(tǒng)（MINI-IMAGING-PAM）[20]。將韭菜葉片暗適應20 min后，在測量光[強度為0.5 μmol/（m2·s），脈沖頻率為1 Hz]下誘導產(chǎn)生初始熒光（F0），隨后用飽和脈沖光[強度為2 500 μmol/（m2·s），脈沖光時間為0.8 s]激發(fā)產(chǎn)生最大熒光（Fm）。當熒光從最大值降至接近F0水平時，用光化光[強度為156 μmol/（m2·s）]來誘導熒光動力學，且每隔20 s打開飽和脈沖進行熒光參數(shù)Fm′和Fs的測定。在每個樣品測定光誘導動力學曲線后，從動力學曲線中導出所需要的參數(shù)數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 硫磺對韭菜產(chǎn)量和硝酸鹽含量的影響

從圖1可以看出，隨著硫磺施用量的增加，韭菜植株地上部鮮重表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢。當土壤施硫7.2 kg/hm2時，韭菜產(chǎn)量為最高，比對照S0提高了10.6%。反映出適宜硫磺施用量可以促進韭菜的生長，提高產(chǎn)量；另外，從圖1中還可以看出，硫磺處理韭菜葉片的硝酸鹽含量均隨著硫施用量的增加呈現(xiàn)先減少后增加的變化趨勢，當土壤施硫7.2 kg/hm2時韭菜硝酸鹽含量最低，較對照S0相比減少了7.2%。

2.2 硫磺對韭菜氮代謝關鍵酶NR、GS、GOT和GPT活性的影響

硝酸還原酶（NR）是氮素同化的關鍵酶，其催化的反應是NO3-同化為NH4+的限速步驟。由圖2可以看出，施硫處理能提高NR的活性，但NR活性隨土壤施硫量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，當土壤施硫為7.2 kg/hm2時，NR活性最高，比S0提高了10.7%（圖2）。由此可以看出，施硫可以加速氮同化的啟動，但硫施用量過高時，對NR活性有抑制的作用，可能是硫同化和氮同化競爭活化能量的原因。隨著硫施用量的增加，硫磺處理后的韭菜葉片GS活性表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢（圖2）。

谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT）和谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）為2個重要的轉氨酶。硫磺處理后的第9天，隨著硫施用量的增加，GOT和GPT活性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢（圖3），硫施用量為54.0 kg/hm2時效果最為顯著，比對照S0分別增加了9.4%和22.5%。

2.3 硫磺對韭菜葉片葉綠素熒光動力學參數(shù)的影響

土壤施用硫磺后，韭菜葉片葉綠素a和葉綠素b含量均隨著硫施用量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（表1），當硫施用量為7.2 kg/hm2時，硫磺處理的韭菜葉片葉綠素a和葉綠素b含量均達到最大，比對照S0分別提高了16.9%、15.5%。從表1中還可看出，土壤施硫處理均可提高韭菜葉片的吸光系數(shù)（Abs），當硫施用量為7.2 kg/hm2時達到最高，比對照S0提高了10.2%。當硫施用量大于7.2 kg/hm2時，韭菜葉片Abs隨著硫施用量的增加逐漸下降。

隨著硫施用量的升高，硫磺處理后的韭菜葉片PSII最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、韭菜葉片ETR、韭菜葉片實際光化學量子產(chǎn)量Y（Ⅱ）和調節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPQ）均呈現(xiàn)出先增加后降低得趨勢（表1）。硫施用量為7.2 kg/hm2時達到最高，而非調節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NO）呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。

2.4 硫磺對韭菜氮代謝產(chǎn)物的影響

由圖4可以看出，韭菜葉片可溶性蛋白的含量隨硫施用量的增加而增加，不同水平的硫處理比S0分別提高了13.9%、9.9%、6.6%和5.2%。植物的干物率在一定程度上可以反映出植物在一段時間內(nèi)的物質積累量，不同硫水平下的韭菜幼苗干物率隨著硫施用量的增加表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢（圖4），其中，在硫施用量為7.2和18.0 kg/hm2時干物率增加效果最為明顯，分別比對照S0提高了6.86和7.9個百分點。韭菜葉片中游離氨基酸的含量隨硫施用量的增加呈先增加后降低的趨勢（圖5），在硫施用量為7.2 kg/hm2時達到峰值，為24.5 mg/100 g（FW）。

3 討論

在氮代謝NO3-到蛋白質的整個過程中，NR作為重要的調節(jié)酶和限速關鍵酶，調控整個氮素還原同化進程[21]。NR活性受底物（細胞質內(nèi)硝酸鹽）濃度所誘導[22]，但過量的硝態(tài)氮會被運輸?shù)揭号葜匈A積備用[23]。葉勇等[24]認為一定的硫水平能明顯提高硝酸還原酶（NR）的活性，促進氮素代謝。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，NR活性隨著硫施用量的增加呈先上升后下降的趨勢，也反映出適宜的硫施用量有促進韭菜葉片硝酸還原酶的生成和激活作用，而硫施用量過高反而會降低NR活性，可能是由于硫素施用量過高會導致氮硫同化競爭活化能量，表現(xiàn)出對硝酸還原酶的抑制，從而影響植物氮代謝的順利進行[25]。提高植物體內(nèi)NR活性從理論上可以提高氮素的利用率，降低蔬菜中硝酸鹽的含量。然而，基因表達和蛋白質水平上的研究方法已經(jīng)表明，酶的總量不是限制胞內(nèi)NR活性的因素，NR在復雜的轉錄和翻譯水平上被調節(jié)。因此，硫對NR活性的調節(jié)機制還要在分子水平上進一步研究。本試驗還發(fā)現(xiàn)，施硫可提高GS、GOT和GPT活性，說明施硫不僅促進了韭菜葉片氮代謝中硝酸鹽的還原與同化，同時還調動轉氨作用的積極協(xié)同配合，促進了硝態(tài)氮轉化為游離氨基酸和可溶性蛋白，這可能是土壤施硫處理降低韭菜硝酸鹽累積的一個重要原因。

硫的供應水平對葉綠體的形成和光合作用的改善有重要影響。劉中良等[26]試驗研究指出，硫肥可顯著提高大蒜葉片葉綠素含量，增強光合作用。劉麗君等[27]研究表明，施硫能增加大豆葉面積，并顯著提高大豆葉綠素含量，有利于增加產(chǎn)量。朱英華等[28]等研究指出，施用適宜量的硫對煙草葉片光合有效量子產(chǎn)量（EQY）、光合電子傳遞速率（ETR）、光化學淬滅（qP）有明顯提高作用，高硫或低硫都會導致煙草EQY、ETR、qP降低和NPQ的升高。本研究結果亦表明施硫可提高韭菜葉片葉綠素的含量，且適宜施用量的硫磺可促進PSⅡ的光能捕獲、吸收與傳遞更多的能量，為氮代謝（如亞硝酸鹽還原和氨同化）和硫代謝（如硫酸鹽還原）等提供充裕的能量，提高光合效率。光合作用的改善對提高生物累積量、可溶性糖、C-骨架和韭菜的產(chǎn)量奠定了基礎。另外，施用硫磺后韭菜葉片生長量增大，對硝態(tài)氮產(chǎn)生了稀釋效應，使單位重量蔬菜NO3-的含量下降，從而降低了硝酸鹽的累積。

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