摘要：以長額負蝗、短額負蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中華稻蝗和中華蚱蜢6種蝗蟲為材料，以蘆丁作為標準品，探索了高效液相色譜法測定蝗蟲中黃酮類化合物含量的方法。色譜條件為色譜柱C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V），進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。檢測得到長額負蝗、短額負蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中華稻蝗和中華蚱蜢中的黃酮類化合物含量分別為11.201、13.776、5.035、13.827、5.565、7.181 mg/g。該方法簡便、準確、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好，可用于測定蝗蟲中黃酮的含量，結(jié)果表明蝗蟲是黃酮類化合物含量很高的資源生物，進一步研發(fā)具有廣闊前景。

關(guān)鍵詞：蝗蟲；黃酮類化合物；提?。粶y定；高效液相色譜

中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4785-04

黃酮類化合物（Flavonoids）是廣泛存在于植物體的一大類化合物，目前已知種類達8 000多種。研究證明黃酮類化合物主要有以下生物學(xué)作用：保護心腦血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫、抗癌抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒、抗氧化、抗輻射等[1-4]，是目前保健品中添加量最多的功能性物質(zhì)之一?；认x屬直翅目昆蟲，世界上現(xiàn)已記載的蝗蟲種類多達10 000種，我國已知蝗蟲超過1 000種[5-7]?；认x不僅具有非常好的資源優(yōu)勢，還具有豐富的功能成分。見諸報道的研究包括功能性脂肪酸和磷脂的研究；抗凍蛋白、儲存蛋白、熱休克蛋白的研究[8-11]；但鮮見有從蝗蟲中分離純化出黃酮類物質(zhì)的報道[12-20]。

本研究通過對長額負蝗[Atractomorpha lata （Motschoulsky）]、短額負蝗（A. sinensis Bolivar）、斑角蔗蝗（Hieroglyphus annulicomis Shir）、山稻蝗（Oxya agavisa Tsai）、中華稻蝗[O. chinensis （Thunberg）]和中華蚱蜢[Acrida cinerea （Thunberg）]6種蝗蟲中黃酮類化合物的提取工藝進行優(yōu)化，建立了提取物高效液相色譜檢測方法，并測定其黃酮類化合物的含量，為蝗蟲黃酮類化合物資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料分別采集于湖北省黃岡市英山縣和黃州區(qū)（表1）。

1.2 試劑

蘆?。ò⒗≡噭┕?，批號為1108860），甲醇（色譜純），磷酸；石油醚（沸程30～60 ℃）、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、正丁醇、三氯化鋁、濃氨水等均為分析純；超純水。

1.3 儀器

高效液相色譜儀（2695，美國Waters公司），配備二極管陣列檢測器；色譜柱，Symmetry 300TM C18（5 μm， 4.6 mm×250 mm，美國Waters公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX-9240MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；快速粉碎機（GDYQ-704S，廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（AB204-E，上海精細天平有限公司）；脂肪測定儀（SZF-06A，上海精隆科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水真空泵（SHZ-Ⅲ型，上海亞榮生化儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程 工藝流程參照文獻[12]，流程如下：山稻蝗經(jīng)鑒定后-40 ℃冷凍處死，保存，試驗時稱取冷凍山稻蝗，去消化道后放入烘箱中干燥至恒重，再將烘干的山稻蝗進行粉碎過40目篩，密封包扎備用；以石油醚為脫脂劑，將粉末用于脂肪測定儀于70 ℃恒溫回流6 h以脫去脂肪，殘渣揮去石油醚后干燥備用；準確稱量（1.0 g）脫脂山稻蝗粉末水浴回流提取黃酮，進行正交試驗。

1.4.2 高效液相色譜測定 參照文獻[20]的方法，稍作調(diào)整。將提取的黃酮溶液用甲醇稀釋10倍，過0.22 μL微孔有機濾膜后備用。色譜條件為Symmety C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：268 nm；色譜柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝗蟲黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗 分別探索不同有機溶劑、甲醇濃度、浸提時間、浸提溫度、料液比對提取效率的單因素試驗。單因素試驗結(jié)果表明，甲醇、甲醇濃度80%、浸提時間2.5 h、浸提溫度75 ℃、料液比（1∶40，m/V）時對蝗蟲黃酮的提取效果最好。

2.1.2 正交設(shè)計優(yōu)化 為更加全面考察各影響因素，設(shè)計了4因素4水平的正交試驗，試驗因素水平見表2。

根據(jù)試驗因素水平表進行正交試驗，測得正交試驗結(jié)果見表3。從試驗數(shù)據(jù)分析可以看出，各因素對黃酮類化合物提取效果的影響大小為浸提時間>甲醇濃度>浸提溫度>料液比。

2.2 6種蝗蟲黃酮的最佳提取工藝分析

其他5種蝗蟲的提取工藝試驗探究及優(yōu)化與山稻蝗的基本相同，經(jīng)試驗探究確定其最佳提取條件見表4。

2.3 6種蝗蟲中的黃酮含量分析

通過試驗確定高效液相色譜法測定黃酮條件及其相應(yīng)含量見表5。

從表5可以看出，不同種類的蝗蟲黃酮類化合物含量差異較大，從蝗蟲類群來看，斑腿蝗科的山稻蝗的含量最高，為13.827 mg/g，斑角蔗蝗和中華稻蝗的含量較低，其中斑角蔗蝗的含量最低，為5.035 mg/g；錐頭蝗科負蝗屬的2種蝗蟲黃酮含量都較高；劍角蝗科中華蚱蜢含量居中，為7.181 mg/g?；认x黃酮類化合物的含量沒有表現(xiàn)出分類類群的規(guī)律性，相關(guān)高效液相色譜圖見圖1-6。

2.4 加標回收試驗

取不同濃度的黃酮提取液0.5 mL，分別放入5支試管中，再分別加入蘆丁標準品。其余步驟按“1.4.2”進行，測定其峰面積，計算其回收率為98.23%，檢測方法的回收率都滿足試驗的要求。

2.5 精密度試驗

準確量取黃酮甲醇溶液1 mL，其余步驟按“1.4.2”進行，測定其峰面積，重復(fù)5次。平行測定結(jié)果的相對標準偏差為0.87%，可滿足試驗要求。

3 小結(jié)與討論

影響蝗蟲中黃酮類化合物提取效果的主次順序為：浸提時間>甲醇濃度>浸提溫度>料液比。通過測定方法規(guī)范研究確定了HPLC法測定黃酮含量的條件為：色譜柱C18 （5 μm，250 mm × 4.6 mm）；進樣量為10 μL；流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（50∶50，V/V）；流速為1.0 mL/min；試驗測出的長額負蝗、短額負蝗、斑角蔗蝗、山稻蝗、中華稻蝗和中華蚱蜢中的黃酮含量分別為11.201、13.776、5.035、13.827、5.565、7.181 mg/g。本測定方法較以往的方法更快速、簡便、準確、實用性強?；认x含有豐富的黃酮類化合物，且種類間的差異較大。山稻蝗的含量最高，為13.827 mg/g，斑角蔗蝗的含量最低，為5.035 mg/g。由此可見，蝗蟲是一種很好的天然黃酮源。

目前有關(guān)黃酮類物質(zhì)的主要研究對象為植物[15，16]，關(guān)于動物中黃酮類物質(zhì)的研究報道較少，所研究的蝗蟲種類也很少，且蝗蟲中黃酮類物質(zhì)的含量測定多使用傳統(tǒng)的比色法。應(yīng)用高效液相色譜法對蝗蟲中總黃酮的含量進行測定，該方法靈敏度高、準確、重現(xiàn)性好。該研究為蝗蟲的黃酮類物質(zhì)的綜合開發(fā)利用提供一定技術(shù)參數(shù)與試驗依據(jù)。本研究中6種蝗蟲的黃酮類化合物含量遠遠高于霍山蹦蝗（0.41%）[12]和蜂蛹（0.45%）[17]的含量，甚至比常見的中草藥如葛根（1.7%）[18]、木犀草（1.9%）[19]、銀杏葉的黃酮含量[20，21]（2.9%）都高。

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