摘要：利用幼畜胚胎體外生產(chǎn)與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)能夠獲得大量卵母細(xì)胞，縮短世代間隔，加快育種進(jìn)程。但幼畜卵母細(xì)胞形態(tài)及代謝與成年動(dòng)物存在差異，這導(dǎo)致幼畜胚胎發(fā)育能力低。目前，對(duì)JIVET技術(shù)的研究主要是通過(guò)改進(jìn)激素處理方案及體外培養(yǎng)條件來(lái)增加卵母細(xì)胞數(shù)量并增強(qiáng)卵母細(xì)胞發(fā)育能力。從供體羔羊的選擇、激素處理和卵母細(xì)胞的發(fā)育等方面對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：幼畜胚胎體外生產(chǎn)與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)；羔羊；卵母細(xì)胞

中圖分類號(hào)：S826；S814.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）19-4726-04

幼畜胚胎體外生產(chǎn)與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術(shù)是集幼畜超數(shù)排卵、卵母細(xì)胞的體外成熟和體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植為一體的高新技術(shù)體系。利用JIVET技術(shù)能夠獲得大量卵母細(xì)胞，縮短優(yōu)良母畜繁殖的世代間隔，加快品種培育的進(jìn)程[1]。與傳統(tǒng)的綿羊超數(shù)排卵和胚胎移植（MOET）方案相比，由于生產(chǎn)體外胚胎的卵母細(xì)胞供體母畜的年齡提前到8～12周齡，故生產(chǎn)后代羔羊的世代間隔縮短為6個(gè)月，同時(shí)還大大增加了后代數(shù)量，繁殖效率成倍提高。此外，JIVET技術(shù)結(jié)合性控精液進(jìn)行后代生產(chǎn)，也能提高基因遺傳率約5%，這為該技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用提供了非常廣闊的應(yīng)用前景。

JIVET技術(shù)應(yīng)用的原理在于羔羊出生后的前2個(gè)月卵巢生長(zhǎng)較快，卵巢的質(zhì)量在4周齡和8周齡時(shí)分別增加了6.8倍和10.8倍，生長(zhǎng)卵泡數(shù)量在4周齡時(shí)顯著增加[2]。生長(zhǎng)卵泡數(shù)量和卵巢的質(zhì)量在8～12周齡時(shí)下降，一直持續(xù)到33周齡[2]。卵泡在4周齡時(shí)出現(xiàn)閉鎖信號(hào)，在8～10周齡時(shí)達(dá)到最大值[3]。這些結(jié)果顯示3～8周齡時(shí)卵泡生長(zhǎng)旺盛，能搜集到大量的未閉鎖卵母細(xì)胞。研究表明，羔羊?qū)ν庠创傩韵偌に仄鸱磻?yīng)，但部分羔羊?qū)に夭幻舾衃3]。與成年羊相比，羔羊胚胎體外培養(yǎng)時(shí)以及移植到受體后的發(fā)育能力都很低[4]，這導(dǎo)致胚胎移植后胎兒流產(chǎn)和畸形率高[5]，極大地制約了JIVET技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用。而通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募に靥幚矸桨负腕w外胚胎生產(chǎn)體系能顯著提高3～4周齡羔羊生產(chǎn)后代的能力[6，7]。目前研究表明，影響JIVET效率的因素主要包括供體的選擇、超排方案和卵母細(xì)胞的發(fā)育能力等[8，9]。本文就羔羊JIVET技術(shù)的影響因素進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1 供體羔羊的選擇

理想的供體羔羊在激素處理后將產(chǎn)生大量的卵泡和高發(fā)育能力的卵母細(xì)胞。影響供體羔羊選擇的因素包括遺傳背景、年齡等。

1.1 遺傳背景

羔羊遺傳背景主要包括品種、基因型和個(gè)體差異等。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，成年后排卵數(shù)高的綿羊品種性成熟前卵巢和卵泡發(fā)育滯后于成年后排卵數(shù)低的品種，且前者對(duì)激素的敏感性低于后者[10，11]。Sonjaya等[12]對(duì)剛出生的羔羊卵巢進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)法蘭西（成年后排卵數(shù)低）各級(jí)卵泡數(shù)比羅姆尼（成年后排卵數(shù)高）多，且前者各級(jí)卵泡直徑大于后者。4周齡時(shí)，法蘭西3級(jí)卵泡數(shù)量多于羅姆尼，且前者直徑大于后者。外源激素分別處理4周齡羔羊，能夠誘導(dǎo)法蘭西羔羊排卵，而羅姆尼不反應(yīng)。白佳樺[10]用相同激素處理方法處理幾個(gè)品種的羔羊，平均每只羔羊采集到的卵母細(xì)胞數(shù)排卵數(shù)高的品種顯著低于排卵數(shù)低的品種。多胎基因FecB能夠影響羔羊卵泡發(fā)育，3月齡不攜帶FecB基因的布魯拉羊（Booroola）比攜帶FecB基因的布魯拉羊擁有更多的大卵泡[11]。Ptak等[13]發(fā)現(xiàn)一只羔羊卵母細(xì)胞具有很高的發(fā)育能力，其生產(chǎn)的5只同胞羔羊的卵母細(xì)胞同樣具有很高的發(fā)育能力，這說(shuō)明基因型一致的羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力也趨于一致。

1.2 供體年齡

不同年齡段羔羊激素處理后卵巢反應(yīng)不同。Armstrong[14]認(rèn)為激素處理羔羊的最佳年齡為4～6周齡，因?yàn)榇藭r(shí)大部分卵泡處于應(yīng)答狀態(tài)。O’Brien等[15]指出，3～6周齡羔羊卵母細(xì)胞超排效果好于16～24周齡羔羊。Morton等[6]用激素處理不同年齡（3～4周齡和6～7周齡）羔羊，發(fā)現(xiàn)羔羊年齡影響到子宮質(zhì)量，但對(duì)卵巢質(zhì)量、卵泡數(shù)量和獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有影響。然而，6～7周齡羔羊卵母細(xì)胞囊胚率（27.9%）高于3～4周齡羔羊（20.4%），證明羔羊隨著年齡的增長(zhǎng)其卵母細(xì)胞發(fā)育能力增強(qiáng)。盡管如此，年輕的羔羊（4～6周齡）激素處理效果和最終獲得的后代數(shù)顯著高于年長(zhǎng)的羔羊。

2 激素誘導(dǎo)應(yīng)答

幼畜對(duì)激素的應(yīng)答個(gè)體差異很大[5，13]。Ptak等[13]發(fā)現(xiàn)50%～72%的2～7月齡羔羊?qū)に胤磻?yīng)（卵泡數(shù)量和大小）不明顯。相反，Morton等[6]發(fā)現(xiàn)所有3～4周齡羔羊卵巢對(duì)激素應(yīng)答，其中24%應(yīng)答弱，44%應(yīng)答中等，32%應(yīng)答強(qiáng)；對(duì)6～7周齡羔羊的試驗(yàn)結(jié)果也相差不大。Ptak等[5，13]發(fā)現(xiàn)對(duì)激素應(yīng)答弱的羔羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)后不能發(fā)育至囊胚。相反，Morton等[6]發(fā)現(xiàn)3～4周齡和6～7周齡羔羊卵巢激素應(yīng)答弱的卵母細(xì)胞具有發(fā)育到囊胚的能力。然而，激素應(yīng)答弱和應(yīng)答中等的羔羊卵巢其可用卵母細(xì)胞百分比無(wú)顯著差異，但高于激素應(yīng)答強(qiáng)的羔羊。3～4周齡羔羊不同激素應(yīng)答強(qiáng)度的卵母細(xì)胞卵裂率和囊胚率無(wú)顯著差異；但6～7周齡羔羊激素應(yīng)答強(qiáng)的卵母細(xì)胞卵裂率低[6]。激素處理方案的改變使更多的羔羊?qū)に貞?yīng)答，提高了JIVET效率。選擇適當(dāng)?shù)募に靥幚矸椒苁勾蟛糠指嵫驊?yīng)答明顯。

3 激素處理方法

激素處理羔羊能增加卵巢中可用卵泡數(shù)量，并獲得大量卵母細(xì)胞[6，15]。激素處理后羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育速度加快[6，15]。幼畜卵巢對(duì)激素應(yīng)答及卵母細(xì)胞發(fā)育能力增強(qiáng)的確切機(jī)制還不清楚。激素應(yīng)答過(guò)程伴隨著卵泡變大及卵母細(xì)胞生物合成反應(yīng)的進(jìn)行[14]，為卵母細(xì)胞受精后的發(fā)育做準(zhǔn)備。激素處理后，羔羊卵泡細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)和卵泡內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變[15]。例如，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞內(nèi)促性腺激素受體的形成，促使卵泡對(duì)促性腺激素反應(yīng)能力增強(qiáng)，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和功能。羔羊超數(shù)排卵的激素用法一般參照成年羊超排方案，即促性腺激素法或孕酮結(jié)合促性腺激素法。

3.1 促性腺激素法

單次或多次注射促卵泡成熟激素（FSH）不能影響每只羔羊采集的卵母細(xì)胞數(shù)量[5，16]。然而，多次FSH處理能提高卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚的能力[5，17]。羔羊超數(shù)排卵的激素用量低于成年綿羊，因?yàn)楦嵫蝮w重低于成年羊且羔羊卵泡對(duì)激素非常敏感[2]。但相比成年動(dòng)物，低劑量促性腺激素造成激素與卵母細(xì)胞結(jié)合的量減少，這就造成卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)發(fā)育能力減弱。研究表明大劑量促性腺激素能提高幼畜卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟能力。目前，羔羊JIVET的最佳FSH劑量為130～160 mg[6，17，18]。馬絨毛膜促性腺激素（eCG）不能增加羔羊超數(shù)排卵后采集的卵母細(xì)胞數(shù)量，但能提高其囊胚率[17，18]。目前報(bào)道的能顯著提高卵母細(xì)胞囊胚率的超排方法是每隔12 h注射1次FSH（40 mg/次），連續(xù)注射4次，最后1次注射FSH時(shí)同時(shí)注射500 IU eCG，在第一次注射FSH后48 h采集卵母細(xì)胞[17]。

3.2 孕酮+促性腺激素法

促性腺激素和孕酮一起使用能增加幼畜超排的卵母細(xì)胞數(shù)量和體外發(fā)育能力[6，15]。孕酮處理7 d后停藥，卵巢上可見(jiàn)卵泡比未用藥前多了2倍[16]。然而，停藥后卵母細(xì)胞處于不同的成熟期，說(shuō)明孕激素處理雖然增加了卵泡的數(shù)量，但降低了卵母細(xì)胞質(zhì)量。且孕激素處理后再注射FSH與僅注射FSH相比沒(méi)有影響采集到卵母細(xì)胞數(shù)量。

4 幼畜卵母細(xì)胞形態(tài)和代謝特點(diǎn)

研究表明，幼年動(dòng)物和成年動(dòng)物卵母細(xì)胞的細(xì)胞器在形態(tài)上存在明顯不同。比如，同期幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞比成年動(dòng)物卵母細(xì)胞的直徑小，但GV期時(shí)其胞質(zhì)細(xì)胞器（如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴）形態(tài)和成年動(dòng)物相似[19]。而幼年動(dòng)物放射冠細(xì)胞觸角比成年動(dòng)物少，體外成熟時(shí)皮質(zhì)顆粒遷移延遲[16]。

卵母細(xì)胞成熟時(shí)蛋白質(zhì)的合成依靠卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞相互作用，這是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂及胚胎正常發(fā)育的前提[20]。體外成熟過(guò)程中卵母細(xì)胞攝入的氨基酸[21-23]及合成的蛋白質(zhì)[23]很少，幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)合成峰值出現(xiàn)的時(shí)間與成年動(dòng)物不同[23]，這是因?yàn)槁亚?卵母細(xì)胞間相互作用存在缺陷[21，22]。此外，幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞內(nèi)成熟促進(jìn)因子（MPF）合成水平和構(gòu)象與成年動(dòng)物相似，但成熟后幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞MPF活性低于成年動(dòng)物[22]。

幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞代謝也不同于成年動(dòng)物。體外成熟過(guò)程中幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞谷氨酰胺代謝水平低于成年動(dòng)物，葡萄糖和丙酮酸代謝水平和成年動(dòng)物相似。以上結(jié)果表明幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞形態(tài)、代謝和超微結(jié)構(gòu)與成年動(dòng)物有所不同，但這些研究所用的羔羊年齡范圍大（40 d至6個(gè)月），且所用的激素處理方案不同，這些可能影響到試驗(yàn)結(jié)果。

5 幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外發(fā)育潛力

與成年動(dòng)物卵母細(xì)胞相比，幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟時(shí)減數(shù)分裂速率相差不大[22]， 且幼年動(dòng)物卵母細(xì)胞體外生產(chǎn)的囊胚在形態(tài)上無(wú)差別，其總細(xì)胞數(shù)[23，24]及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比率[23，24]差異不顯著，但其異常受精率高[22，23]且囊胚率低[13，17]。目前一般將這種情況歸結(jié)于細(xì)胞質(zhì)成熟的紊亂。細(xì)胞質(zhì)成熟紊亂會(huì)造成受精異常，不能形成正常的雄原核，不能阻止多精入卵，阻止受精卵繼續(xù)發(fā)育。最終造成胚胎基因組表達(dá)異常，預(yù)附植時(shí)胚胎丟失，附植后胚胎發(fā)育失敗[14]。不僅胚胎成活率低，胎兒丟失率[5，13，15]和木乃伊化比率[5]也高。Ptak等[25]報(bào)道稱妊娠中斷發(fā)生在妊娠第40～60天，胎兒丟失發(fā)生在妊娠第80～100天，僅僅6%胚胎能發(fā)育并完成整個(gè)妊娠期。

6 小結(jié)與展望

限制JIVET技術(shù)商業(yè)化的因素包括幼畜對(duì)激素的反應(yīng)不穩(wěn)定、卵母細(xì)胞發(fā)育能力低等。但通過(guò)使用高劑量FSH能誘導(dǎo)所有羔羊卵巢發(fā)育[6]。品種和基因型也會(huì)影響幼畜超數(shù)排卵效果[17，18]。目前，有學(xué)者研究的羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力和成年羊沒(méi)有區(qū)別，且移植后妊娠率高[17，18，26]。所以通過(guò)選育特定基因型通過(guò)JIVET技術(shù)育種或許是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

基因組學(xué)能讓我們更深入地研究成年動(dòng)物和幼年動(dòng)物的區(qū)別。目前已發(fā)現(xiàn)幼畜胚胎內(nèi)幾種重要的發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與成年動(dòng)物不同[27，28]。Ptak等[25]發(fā)現(xiàn)羔羊胚胎移植后胎兒發(fā)育停滯是由于全基因組甲基化水平低造成的。這些基因表達(dá)水平上的研究將使我們更深入地了解幼年動(dòng)物和成年動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎的差異，為進(jìn)一步改進(jìn)幼畜胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)提供理論支持。

目前，幼畜胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，Kelly等[18]進(jìn)行羔羊胚胎體外生產(chǎn)并移植，平均每只供體羔羊能生產(chǎn)16只羔羊后代。而隨著幼畜胚胎體外生產(chǎn)效率的不斷提高，該技術(shù)也將為優(yōu)良家畜繁育及新品種培育等領(lǐng)域提供更加廣闊的應(yīng)用前景。

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