摘要:利用龍鳳濕地不同濃度梯度(100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%)的水樣培養(yǎng)霍夫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri),通過單細胞凝膠電泳試驗檢測霍夫水絲蚓細胞內(nèi)DNA的損傷情況,研究龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓的遺傳毒性效應。結果表明,隨著水樣濃度的增加,霍夫水絲蚓DNA損傷也加大,龍鳳濕地水體具有遺傳毒性,需要重視對龍鳳濕地水質(zhì)的監(jiān)測和治理工作。
關鍵詞:龍鳳濕地;霍夫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri);單細胞凝膠電泳;DNA損傷
中圖分類號:X832 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2013)14-3436-03
大慶市龍鳳濕地自然保護區(qū)位于大慶市龍鳳區(qū)東南,東經(jīng)125°07′-125°15′,北緯46°28′-46°32′,距市中心僅8 km,由烏裕爾河下游流域永久性及季節(jié)性淡水沼澤地和小型潛水湖組成。自然保護面積約為5 996 hm2,核心面積為3 085.07 hm2,緩沖區(qū)面積為609.56 hm2。龍鳳濕地是鳥類重要的繁殖地和遷徙的中繼站,有野生動物207種,其中鳥類有76 種,有丹頂鶴、東方白鸛、大鴇等5種國家一級保護鳥類;有大天鵝、灰鶴、鴛鴦等19種國家二級保護鳥類;有大白鷺、青頭潛鴨等19種省級重點保護鳥類。另外,龍鳳濕地還有魚類45種,維管束植物314種[1]。龍鳳濕地是大慶油田和石油化工的滯洪區(qū),在發(fā)揮防洪、滯洪功能的同時,還起著調(diào)節(jié)城市的小氣候、增加空氣溫度、滯留與降解自然來水中的有害物質(zhì)、美化環(huán)境、豐富市民生活的作用。
1984年,Ostling首創(chuàng)了單細胞凝膠電泳技術(Single cell gel electrophoresis,SCGE),隨后Singh將方法加以完善,形成一種快速檢測單細胞DNA損傷的方法[2]。單細胞凝膠電泳通過對培養(yǎng)動物的細胞懸液進行電泳,從而檢測其DNA損傷,具有靈敏度高、迅速、簡便、經(jīng)濟以及所需細胞少等優(yōu)點。近年來,單細胞凝膠電泳技術廣泛應用于環(huán)境毒理學檢測、細胞凋亡研究、疾病的預防與檢測等領域[3]?;舴蛩z蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)屬環(huán)節(jié)動物門寡毛綱近孔目顫蚓科水絲蚓屬,生活于污染較重的水域,如含有機質(zhì)、腐殖質(zhì)較多的污水溝、排水口等處?;舴蛩z蚓對環(huán)境條件的變化特別敏感,常被作為環(huán)境監(jiān)測的指示動物[4]。本研究利用龍鳳濕地不同濃度梯度(100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%)的水樣培養(yǎng)霍夫水絲蚓,通過單細胞凝膠電泳試驗檢測霍夫水絲蚓細胞內(nèi)DNA的損傷情況,研究龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓的遺傳毒性效應,進而對龍鳳濕地水體毒性進行監(jiān)測,為龍鳳濕地水污染防治和環(huán)境保護提供基礎資料。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物 霍夫水絲蚓購自大慶市讓胡路農(nóng)貿(mào)花鳥魚市場。
1.1.2 儀器 Nikon 80i型熒光顯微鏡、DYY-6C+DYCE-27型電泳儀、DF-101S型集熱加熱式磁力攪拌器、TGL-16M型高速臺式冷凍離心機、Eppendorf微量移液器等。
1.2 方法
1.2.1 水樣的處理 按照《中華人民共和國國家環(huán)境保護標準》中關于天然水樣采集規(guī)定操作[5]。選擇3個樣點,分別標示為A、B、C樣點。用采樣桶每月采樣一次。采回的水樣于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 霍夫水絲蚓的培養(yǎng) 在15~18 ℃條件下將霍夫水絲蚓培養(yǎng)于大培養(yǎng)皿中,每天清洗一次,2~3 d后選取長度相對一致的霍夫水絲蚓為試驗動物。分別設試驗組和對照組,EMS培養(yǎng)液作為陽性對照,蒸餾水作為陰性對照。
1.2.3 急性毒性試驗 將水樣用8層紗布過濾,用蒸餾水將過濾后的水樣配制成質(zhì)量分數(shù)分別為80%、85%、90%、95%、100%的水樣培養(yǎng)液,各取50 mL倒入培養(yǎng)皿中。每組各隨機加入長度相近的霍夫水絲蚓30條,培養(yǎng)3 h,溫度控制在20~22 ℃?;舴蛩z蚓中毒后死亡的癥狀主要表現(xiàn)為身體泛白、失去伸縮能力、用解剖針碰觸完全無反應則為死亡[6]。
1.2.4 單細胞凝膠電泳試驗
1)單細胞懸液的制備。將染毒恢復后的霍夫水絲蚓取出,吸干水分,放入裝有緩沖液的研缽中充分研磨。將研磨液用200目尼龍網(wǎng)過濾、離心,吸取上清液。反復沖洗離心,取上清液。濾液即為霍夫水絲蚓單細胞懸液。
2)DNA損傷測試。按照《現(xiàn)代環(huán)境生物學實驗技術與方法》中單細胞凝膠電泳技術操作[7]。
1.2.5 數(shù)據(jù)分析 選擇有代表性的20個拖尾細胞,切換到圖像分析軟件窗口進行彗星測量、分析[8]。使用SPSS 10.0軟件和CASP軟件進行統(tǒng)計學分析。
2 結果與分析
2.1 A樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷
從圖1可以看出,當龍鳳濕地A樣點水樣稀釋為80%~85%濃度時,DNA損傷程度比較小,而當濃度達85%以上時曲線斜度急速增大,表明霍夫水絲蚓DNA損傷加大。
2.2 B樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷
由圖2可知,當龍鳳濕地B樣點水樣稀釋為80%~85%濃度時,DNA損傷程度比較小,而當濃度達90%以上時,曲線斜度急速增大,說明DNA損傷加大,其原因可能是污水濃度太大,嚴重影響霍夫水絲蚓DNA的復制,使DNA變異,產(chǎn)生嚴重的損傷。
2.3 C樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷
從圖3可以看出,當龍鳳濕地C樣點水樣濃度在80%以上時,DNA損傷急劇上升,且DNA損傷程度較A樣點嚴重,這是由于C樣點更靠近東城區(qū)污水處理廠的排水渠,而A樣點則是在龍鳳濕地的中心地帶,兩個采樣點的水體受污染程序有較大差別。
3 小結與討論
龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓DNA有損傷,但在短時間內(nèi)不足以致使霍夫水絲蚓死亡,說明城市污水經(jīng)處理后流入龍鳳濕地對霍夫水絲蚓短時間內(nèi)的影響不大,其原因可能是龍鳳濕地水體面積太大,使有毒物質(zhì)稀釋;還有可能是排放入龍鳳濕地水體有毒物質(zhì)含量較少,污水處理企業(yè)處理污水達到正常標準。隨著水樣濃度的增加,水中能造成DNA損傷的物質(zhì)濃度也增大,致使霍夫水絲蚓DNA受到的損傷越重。
參考文獻:
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