摘要：通過(guò)分析苦馬豆素（Swainsonine，SW）人工抗原SW-OVA對(duì)小鼠機(jī)體的影響，進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。將36只昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組，每組12只。試驗(yàn)組依次進(jìn)行首免和加強(qiáng)免疫，免疫前采血，分析血清生化指標(biāo)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、α-甘露糖苷酶（AMA）、尿素氮（BUN）的變化，血常規(guī)指標(biāo)紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYM）、血小板數(shù)（PLT）和血紅蛋白含量（HGB）的變化，同時(shí)檢測(cè)免疫組血清中有無(wú)SW，并觀察小鼠臟器系數(shù)及其形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明，免疫組小鼠與對(duì)照組小鼠血清生化指標(biāo)、血常規(guī)指標(biāo)和臟器系數(shù)差異不大，免疫小鼠血清中未檢出SW，鏡檢未見(jiàn)免疫小鼠器官出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。合成的人工抗原SW-OVA具有較好的安全性。

關(guān)鍵詞：苦馬豆素（Swainsonine，SW）；人工抗原；免疫；小鼠

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）14-3370-03

苦馬豆素（Swainsonine，SW）是豆科棘豆屬（Oxytropis）和黃芪屬（Astragalas）等瘋草植物的主要有毒成分[1]。瘋草在中國(guó)分布廣泛，目前對(duì)瘋草蔓延采取的防除方法主要有人工挖除、化學(xué)藥劑滅除等。其中人工挖除僅適用于小面積草場(chǎng)，而且效果并不理想；化學(xué)藥劑滅除極易造成環(huán)境污染，不利于畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。瘋草為豆科植物，營(yíng)養(yǎng)成分較為全面[3]。

目前利用免疫預(yù)防的方法使家畜安全利用瘋草，已經(jīng)成為了國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)[4]。SW分子量小，屬于半抗原，不具有免疫原性。需要將SW與大分子載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原，將合成的人工抗原用于動(dòng)物免疫，即可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗SW的特異性抗體，使動(dòng)物獲得對(duì)瘋草的免疫力。但合成的人工抗原有可能在機(jī)體降解釋放出SW，故需要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估。本試驗(yàn)用人工合成抗原SW-卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）免疫昆明種小鼠，通過(guò)分析血清生化指標(biāo)、血常規(guī)指標(biāo)和臟器系數(shù)，檢測(cè)SW-OVA對(duì)免疫小鼠機(jī)體的影響，并監(jiān)測(cè)小鼠血液中有無(wú)SW，以探討SW-OVA對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響，為抗SW單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

昆明種小鼠36只，雌雄各半，體重（22±2）g，購(gòu)自塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站。

1.2 試劑與儀器

SW-OVA由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；弗氏完全佐劑（FAC）、弗氏不完全佐劑（FAI）購(gòu)自Sigma公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、尿素氮（BUN）、α-甘露糖苷酶（AMA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Carry 100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（無(wú)錫天牧儀器科技有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BS124型精密電子天平（德國(guó)賽多力斯）；VetTest 8008型生化分析儀、StatSpin VT型離心機(jī)（北京安普生化科技有限公司）；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore）。

1.3 抗原的制備

按不同免疫劑量精確稱(chēng)取SW-OVA溶解于一定體積的生理鹽水中，加入等量佐劑混勻，至完全形成白色油包水型乳濁液，小鼠注射劑量為0.2 mL。首免時(shí)佐劑使用FAC，第一次和第二次加強(qiáng)免疫佐劑使用FAI，第三次加強(qiáng)免疫不使用佐劑，完全使用生理鹽水溶解。

1.4 小鼠免疫試驗(yàn)

參考王帥等[5]的研究進(jìn)行免疫試驗(yàn)，對(duì)各免疫組使用FAC進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，再以相同免疫途徑進(jìn)行首免和加強(qiáng)免疫。各免疫組免疫劑量和免疫時(shí)間見(jiàn)表1。對(duì)照組每次注射等體積的抗原乳化液。

1.5 血樣采集及血液指標(biāo)測(cè)定

在每次免疫的當(dāng)天早晨對(duì)每組隨機(jī)取3只小鼠，眼眶取血。當(dāng)日下午進(jìn)行免疫操作，共采血4次。采回的全血3 000 r/min分離血清，進(jìn)行臨床生化指標(biāo)測(cè)定。血清檢測(cè)的指標(biāo)有：谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、α-甘露糖苷酶（AMA）、尿素氮（BUN）。抗凝血用于測(cè)定血常規(guī)指標(biāo)：紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYM）、血小板數(shù)（PLT）和血紅蛋白含量（HGB）。

1.6 免疫小鼠血清中SW的定性檢測(cè)

參考宋毓民等[6]的研究對(duì)血清進(jìn)行前處理，采用薄層層析（TLC）檢查是否含有SW。TLC條件參照文獻(xiàn)[7]，若薄層板Rf為0.48左右處出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn)則判定為檢測(cè)到SW，否則判定檢液不含SW。

1.7 試驗(yàn)小鼠臟器系數(shù)檢測(cè)及器官的組織學(xué)觀察

每次采血的同時(shí)采取小鼠心、肝、脾、肺、腎，準(zhǔn)確稱(chēng)量記錄各臟器重量。計(jì)算出臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=（臟器重/體重）×100%。然后將各器官置于10%的福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，間隔連續(xù)切片，HE染色，鏡檢。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5中One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行多重比較，結(jié)果以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫小鼠血清中SW的定性檢測(cè)結(jié)果

從第一次采血開(kāi)始，到第四次時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組小鼠的血清中未檢測(cè)到SW。

2.2 試驗(yàn)小鼠器官的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果

所有試驗(yàn)組小鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器均未見(jiàn)明顯的眼觀變化；由表2可知，免疫組與對(duì)照組各臟器系數(shù)差異不大；鏡檢各器官組織切片，也未見(jiàn)到細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞核壞死、溶解、消失等SW中毒的典型癥狀。

2.3 試驗(yàn)小鼠血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表3可知，整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)所有試驗(yàn)小鼠血清AST、ALT、LDH、AKP、AMA、BUN、RBC、WBC、LYM、PLT和HGB均變化不大。

3 討論

SW為半抗原，不具有完全的免疫原性，只有將其偶聯(lián)到大分子載體上才能誘導(dǎo)出免疫原性[5]。SW易溶于水，可被動(dòng)物機(jī)體迅速吸收，并很快通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)排出體外，故可對(duì)動(dòng)物體液進(jìn)行SW檢測(cè)，以確定其安全性[7]。本試驗(yàn)中免疫小鼠血清SW檢測(cè)為陰性，說(shuō)明小鼠機(jī)體中無(wú)SW單體。本試驗(yàn)使用的薄層色譜法靈敏度雖然較低，但其對(duì)SW的檢測(cè)下限（0.5 μg）已遠(yuǎn)低于小鼠的中毒劑量[8]，可以用于檢測(cè)動(dòng)物體液中是否含有SW。

據(jù)國(guó)內(nèi)外研究SW可特異性地抑制α-甘露糖苷酶的活性，α-甘露糖苷酶活性的下降是檢測(cè)動(dòng)物瘋草中毒最重要的指標(biāo)[9]。正常情況下AST和ALT主要存在于肝細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死時(shí)，可檢測(cè)到血清中AST和ALT濃度升高[10]。BUN是機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，血液中BUN含量的變化反映了腎臟排氮功能的障礙[9]。LDH存在于機(jī)體組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)動(dòng)物肝臟和心臟等發(fā)生損傷時(shí)，血清LDH值會(huì)急速升高[10]。AKP是臨床檢測(cè)中具有重要意義的一種酶，主要分布于肝、腎和骨組織中，當(dāng)動(dòng)物肝臟組織病變時(shí)其活性會(huì)異常升高。本試驗(yàn)中免疫小鼠的血清生化指標(biāo)值與對(duì)照小鼠差異不大，表明合成的SW-OVA沒(méi)有對(duì)小鼠造成病理性損害，可以作為生物技術(shù)藥品用于小鼠。

白細(xì)胞是血液中重要的一類(lèi)血細(xì)胞，具有吞噬異物并產(chǎn)生抗體的作用，有對(duì)機(jī)體傷病的損傷治愈能力和抗御病原體入侵的能力，以及對(duì)疾病的免疫抵抗力等。淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種，由淋巴器官產(chǎn)生，機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分[11]。紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的血細(xì)胞，同時(shí)也是脊椎動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)血液運(yùn)送氧氣的最主要的媒介，同時(shí)還具有免疫功能。血紅蛋白含量是判斷機(jī)體是否貧血的重要指標(biāo)[12]。血小板是哺乳動(dòng)物血液中的有形成分之一，具有特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化組成，在正常血液中有較恒定的數(shù)量[13]。本試驗(yàn)中免疫小鼠的血常規(guī)指標(biāo)值與對(duì)照組差異不大，表明合成的SW-OVA對(duì)小鼠具有較好的安全性。

臟器系數(shù)是毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中較為重要的指標(biāo)，反映了受試物對(duì)臟器的損害程度[14]。但臟器系數(shù)的變化只能說(shuō)明動(dòng)物的某個(gè)臟器受到受試物的損傷，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的病理組織學(xué)及有關(guān)生化指標(biāo)的檢查。試驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠各臟器系數(shù)均無(wú)顯著性差異，切片鏡檢也未發(fā)現(xiàn)小鼠臟器的毒理性變化，血清生化指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)未見(jiàn)異常變化，合成的SW-OVA安全性較好，具有較好的利用前景。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)血液和組織學(xué)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫小鼠血清生化指標(biāo)、血常規(guī)指標(biāo)及臟器系數(shù)與對(duì)照組差異不大，而且免疫小鼠血清中未檢測(cè)到SW，鏡檢未發(fā)現(xiàn)組織器官有中毒現(xiàn)象。說(shuō)明人工抗原SW-OVA可以安全地利用于小鼠。

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