摘要：根據(jù)GenBank中小鼠的IL-2 cDNA序列設(shè)計(jì)引物，從小鼠肝臟組織中提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出小鼠的IL-2基因。結(jié)果表明，克隆出了IL-2基因，獲得了與預(yù)期大小相一致的850 bp的DNA片段，為研究其組成、結(jié)構(gòu)和利用基因工程生產(chǎn)該藥物打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小鼠；白細(xì)胞介素2（IL-2）基因；反轉(zhuǎn)錄

中圖分類號(hào)：Q958 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）14-3367-03

白細(xì)胞介素2（Interleukin-2，IL-2）是由CD4+ T細(xì)胞在受促有絲分裂素或異源物刺激后分泌的一種15 ku蛋白，具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。1983年，Taniguchi等[1]從ConA刺激的Jurkat白血病T細(xì)胞中成功克隆IL-2 cDNA，并在大腸桿菌中得到高水平的表達(dá)。1986年，人IL-2克隆成功。隨后，IL-2開始應(yīng)用，主要作為免疫治療劑和免疫增強(qiáng)劑。Weinberg等[2]報(bào)道將重組牛IL-2注入牛乳房，可以明顯降低細(xì)菌性乳房炎的發(fā)病率；重組牛所生產(chǎn)的IL-2能促進(jìn)牛病毒性腹瀉死疫苗的免疫效果；IL-2分別與狂犬病疫苗或瘧疾疫苗聯(lián)合使用，對(duì)相應(yīng)抗原的攻擊有保護(hù)作用[3]。

本研究根據(jù)GenBank中小鼠的IL-2 cDNA序列，利用RT-PCR的高度靈敏性、特異性及操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，克隆小鼠IL-2基因，為研究其組成、結(jié)構(gòu)和利用基因工程生產(chǎn)該藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)小鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR所需酶及耗材均購(gòu)于Progema公司；試驗(yàn)所需其他試劑均為分析純，購(gòu)于上海強(qiáng)智生物科技有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝臟組織的總RNA

采用Trizol法提取肝臟組織總RNA，結(jié)果看出：10個(gè)樣品管中，都出現(xiàn)3條清晰的rRNA條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA，其中含量最多的為35S rRNA，其次為28S rRNA，最少的為5S rRNA（圖1）。

在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，挑選帶型好、雜質(zhì)少、rRNA含量較高的反應(yīng)樣品作進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。第4管提取的RNA的量雖然多，但由于污染了基因組DNA或其他試劑，因此并不適合做反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄模板，第2管和第6管也有一定的污染，且提取的RNA量不多，所以也不適合做反轉(zhuǎn)錄的模板。第1、3、7、8、9、10管提取的量雖然少，但沒有受到污染。第5管提取的RNA質(zhì)量較高，提取的量多、沒有污染、沒有降解，所以是反轉(zhuǎn)錄的最好的模板，下面進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)的模板就是取自第5管的。

2.2 小鼠肝臟組織IL-2基因mRNA進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果

從反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進(jìn)行PCR的結(jié)果可以看出，4個(gè)樣品管都擴(kuò)增出了一條約850 bp大小的條帶，其大小與理論推測(cè)的一致（圖2）。

3 討論

1）本研究中，通過(guò)RT-PCR克隆到與預(yù)期的大小片段一致的DNA片段，說(shuō)明通過(guò)簡(jiǎn)單的RT-PCR技術(shù)就能獲得所需基因的cDNA序列。IL-2基因的克隆只是工作的開始，下一步工作是將獲得的DNA進(jìn)行TA克隆后測(cè)序，驗(yàn)證其序列的準(zhǔn)確性，然后通過(guò)基因工程技術(shù)導(dǎo)入植物種子，以植物種子作為生物反應(yīng)器表達(dá)IL-2干擾素，為干擾素的規(guī)模生產(chǎn)作準(zhǔn)備。

2）RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，基本過(guò)程為：抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該方法具有良好的擴(kuò)增反應(yīng)及特異性、靈敏度，因此在癌癥的早期診斷[4-6]、醫(yī)學(xué)中病毒的快速檢測(cè)[7-9]、細(xì)胞中基因表達(dá)水平的檢測(cè)和細(xì)胞中特定基因的cDNA序列的克隆[10，11]等方面有極廣泛用途。此項(xiàng)技術(shù)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物，二是可以檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA，三是RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)更靈敏，更易于操作。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，大量有價(jià)值的基因被發(fā)現(xiàn)，其序列被全世界研究者共享，因此相關(guān)的序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR直接擴(kuò)增所需基因的cDNA序列，可以節(jié)約合成DNA的成本。

3）RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RNA分離最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過(guò)RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。此外，在提取RNA時(shí)還應(yīng)保證RNA的純度和完整性。

參考文獻(xiàn)：

[1] TANIGUCHI T， MATSUI H， FUJITA T， et al. Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2[J]. Nature，1983，302（5906）：305-310.

[2] WEINBERG A D， SWAIN S L. IL-2 receptor （Tac antigen） protein expression is down-regulated by the 5′-untranslated region of the mRNA[J]. J Immunol，1990， 144（12）：4712-4720.

[3] 李宏梅，郭慧君，李祥瑞，等.重組雞IL-2作為傳染性法氏囊病疫苗免疫增強(qiáng)劑對(duì)雞細(xì)胞免疫水平的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2005，41（6）：13-14.

[4] 彭玉林，鄭文宏，黃強(qiáng)玲.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌外周血hTERT mRNA的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（8）：1272-1273.

[5] 溫洪濤，張 蕾，高冬玲，等.食管癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2 mRNA的表達(dá)[J].河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36（6）：701-702.

[6] 劉 敏，孫 慧，劉賢錫.聚合酶鏈反應(yīng)在前列腺癌診斷中的應(yīng)用[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究，2004，23（2）：125-127.

[7] 馮東舉，周 鋒，周世新，等.應(yīng)用多重反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)病毒性呼吸道感染[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004， 24（5）：452-454.

[8] 袁長(zhǎng)青，李君文.一步單管反轉(zhuǎn)錄PCR快速檢測(cè)水中甲型肝炎病毒[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1999，9（4）：243-245.

[9] 蔡雪珍，董 婷，魏惠永，等.應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)臨診可疑丙型肝炎感染的結(jié)果分析[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，1994，10（2）：146-147.

[10] 祝 驥，馬文麗，毛向明，等.人肥胖基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（4）：395-398.

[11] 吳漢平，吳開春.人環(huán)氧合酶-2（hCOX-2）編碼基因的克隆及其反義核酸轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞的初步研究[J].世界華人消化雜志，2000，8（11）：1211-1217.