張錦梅，王珊珊，楊蘭玲

（青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司，山東青島 266101）

鹽酸法舒地爾（fasudil hydrochloride），化學(xué)名稱為六氫-1-(5-磺酰基異喹啉)-1(H)-1，4-二氮雜卓鹽酸鹽，是一種肌球蛋白輕鏈磷酸化酶、RHO 激酶抑制劑和新型細(xì)胞內(nèi)鈣離子抗結(jié)劑，該藥能改善腦組織微循環(huán)，保護(hù)缺血腦組織，促進(jìn)神經(jīng)再生。高哌嗪是鹽酸法舒地爾合成工藝中用到的一種原料［1］，通常要求其相對于鹽酸法舒地爾的殘留量不得超過0.1%。已有文獻(xiàn)報道采用液相色譜法［2–3］、紫外分光光度法［4］檢測鹽酸法舒地爾中法舒地爾含量及氣相色譜法［5］測定鹽酸法舒地爾中殘留溶劑的含量。而至今未見關(guān)于離子色譜法檢測鹽酸法舒地爾及原料高哌嗪的報道。筆者建立了非抑制電導(dǎo)陽離子色譜法測定鹽酸法舒地爾原料藥中高哌嗪的含量，方法準(zhǔn)確度高、精密度好、簡便易行，可用于鹽酸法舒地爾生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：CIC–300 型，內(nèi)置柱溫箱，青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司；

優(yōu)普超純水機(jī)：UPL–II 型，成都優(yōu)普純水儀有限公司；

電子天平：AL 104 型，瑞士梅特勒–托利多儀器有限公司；

甲烷磺酸：分析純，國藥集團(tuán)藥業(yè)有限公司；

乙腈：色譜純，德國Merk 公司；

高哌嗪對照品、鹽酸法舒地爾：某制藥廠提供；

實驗用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：SH–CC–3 柱（100 mm×4.6 mm）；淋 洗 液：5.0 mmol／L 甲 烷 磺 酸– 乙 腈（體 積 比90∶10），流速為0.7 mL／min；柱溫：30 ℃；直接電導(dǎo)檢測；進(jìn)樣量：100 μL。

1.3 溶液配制

高哌嗪對照品溶液：1 mg／mL，精密稱取高哌嗪對照品適量，用超純水溶解并稀釋而成；

系統(tǒng)適用性試驗溶液：準(zhǔn)確稱取鹽酸法舒地爾和高哌嗪對照品適量，用超純水溶解并稀釋制成鹽酸法舒地爾質(zhì)量濃度為3 mg／mL、高哌嗪質(zhì)量濃度為3 μg／mL 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液；

供試品溶液：取鹽酸法舒地爾約0.5 g，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加超純水溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液的選擇

高哌嗪的測定參照離子色譜測試方法（中國藥典2010 年版二部附錄VJ［6］）規(guī)定。根據(jù)法舒地爾及高哌嗪的化學(xué)結(jié)構(gòu)選擇以羧酸基鍵合硅膠基質(zhì)作為填料的離子色譜柱。分別研究了濃度為2.5，5.0，7.5 mmol／L 甲烷磺酸淋洗條件下系統(tǒng)適用性試驗中高哌嗪和法舒地爾的出峰及分離情況。試驗發(fā)現(xiàn)即使甲烷磺酸濃度高達(dá)7.5 mmol／L 時，60 min 內(nèi)只有高哌嗪能夠出峰，法舒地爾不出峰，且高哌嗪峰與系統(tǒng)峰分離效果不佳。因此考慮選取在中間濃度5 mmol／L 甲烷磺酸淋洗液中加入一定量的有機(jī)溶劑（如乙腈）來縮短法舒地爾出峰時間。由于此款色譜柱所容許耐受的有機(jī)溶劑的最高使用極限為15%（體積分?jǐn)?shù)），故選擇乙腈的體積分?jǐn)?shù)為5%，10%，15%進(jìn)行對比試驗。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%時，分析時間太長無法滿足要求；當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%，15%時，分析時間可以滿足要求。考慮到色譜柱使用過程中長期處于有機(jī)溶劑最大耐受極限可能會縮短色譜柱的使用壽命，甚至造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，故最終選擇5 mmol／L 甲烷磺酸添加10%乙腈作為淋洗液，既可以滿足實驗需要又能保證在合適的條件下使用色譜柱。

2.2 淋洗液流速的選擇

除淋洗液組成外，淋洗液流速也是影響分離度和色譜峰形的關(guān)鍵因素之一。實驗考察了淋洗液流速分別為0.5，0.7，0.9 mL／min 時對分離效果的影響。結(jié)果表明，低流速下分析時間長，色譜峰形不好；而較高流速下，柱子長時間在高壓狀態(tài)下工作容易造成柱子損傷；當(dāng)流速為0.7 mL／min 時柱壓適宜且分離效果良好、峰形理想，滿足實驗要求。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

按照1.2 色譜條件及進(jìn)樣方法，做系統(tǒng)適用性試驗，色譜圖見圖1。圖1 色譜圖中，高哌嗪和法舒地爾的分離度為6.6，理論塔板數(shù)按高哌嗪峰計算大于1 000。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗溶液色譜圖

2.4 工作曲線方程

精密吸取高哌嗪對照品溶液，逐級稀釋后配制成質(zhì)量濃度分別為2.0，4.0，8.0，10.0，20.0 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2 色譜條件下測定。以色譜峰面積Y對高哌嗪質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為Y=2.0×107X–2 159.2，相關(guān)系數(shù)r=0.992 4。高哌嗪對照品溶液色譜圖見圖2。

圖2 高哌嗪對照品溶液色譜圖

2.5 檢出限與定量限

稀釋高哌嗪對照品溶液并進(jìn)樣分析，至高哌嗪色譜峰近基線波動，重復(fù)進(jìn)樣3 次。當(dāng)S／N=3∶1時，計算高哌嗪的檢出限為0.049 4 μg／mL；當(dāng)S／N=10∶1 時，計算高哌嗪的定量限為0.151 μg／mL。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，高哌嗪峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果

2.7 空白樣品測定

對6 份空白鹽酸法舒地爾樣品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，樣品溶液中未檢出高哌嗪殘留，見圖3。

圖3 空白供試品溶液色譜圖

2.8 回收試驗

在3 mg／mL 空白鹽酸法舒地爾溶液中加入2.4，3.0，3.6 μg／mL 3 個水平的高哌嗪溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表2。由表2 可知加標(biāo)回收率為97.6%～98.7%。

2.9 耐用性試驗

在1.2 色譜條件下，分別控制淋洗液流速（0.7mL／min）變化±0.14 mL／min、柱溫（30℃）變化±5℃、甲烷磺酸濃度（5.0 mmol／L）變化±2.5 mmol／L、乙腈體積分?jǐn)?shù)（10%）變化±5%時，計算對照品溶液色譜峰面積結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，在所選實驗參數(shù)變化范圍內(nèi)，高哌嗪對照品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.5%，證明了所建立方法的可靠性。

表2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

表3 耐用性試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用離子色譜法測定鹽酸法舒地爾中高哌嗪含量，具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，精密度好，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，為鹽酸法舒地爾的質(zhì)量控制提供了參考。該法適用于實際生產(chǎn)中中間體測定與成品的快速檢測，減少了液相色譜分析中有機(jī)相的使用，有利于環(huán)境環(huán)保。

［1］ 姚建文，王成鵬，張秀娟，等.鹽酸法舒地爾的合成［J］.齊魯藥事，2012，31(8): 438–439.

［2］ 葛欣，孟祥軍，李娜然.測定鹽酸法舒地爾的有關(guān)物質(zhì)［J］.光譜實驗室，2011，28(4): 1 908–1 910.

［3］ 樂健，石寬，聞俊，等.用HPLC 法測定鹽酸法舒地爾注射液中鹽酸法舒地爾的含量［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2012，12(1): 14，24.

［4］ 呂潔，孟祥軍，鄒春陽.紫外–可見分光光度法測定鹽酸法舒地爾注射液中鹽酸法舒地爾的含量［J］.中國醫(yī)藥指南，2011，9(5): 26–28.

［5］ 陳晶晶，雷咪，干偉，等. GC 法檢測鹽酸法舒地爾中有機(jī)溶劑殘留量［J］.中國藥師，2012，15(3): 365–366.

［6］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.