張玲，陳大舟，武利慶，高運(yùn)華，湯樺，王晶

（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

劉新海

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院，北京 100144）

含量測(cè)量是核酸測(cè)量的首要問題，世界工業(yè)先進(jìn)國(guó)家計(jì)量機(jī)構(gòu)均已針對(duì)核酸含量測(cè)量開展了基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。核酸含量測(cè)量應(yīng)用廣泛，包括實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)、基因芯片、電化學(xué)傳感器和納米技術(shù)等。這些技術(shù)領(lǐng)域質(zhì)控體系的建立，需要依照權(quán)威測(cè)量和計(jì)量方法研制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用保證核酸測(cè)量量值的溯源與傳遞。

目前國(guó)際上現(xiàn)有的具有明確溯源途徑的高準(zhǔn)確性核酸測(cè)量方法有酶解DNA 產(chǎn)物的液相色譜-串聯(lián)同位素稀釋質(zhì)譜方法HPLC-IDMS［1-4］和DNA 中磷元素的電感耦合等離子體發(fā)射光譜法ICP-OES［5-7］。

DNA 酶解法可適用于長(zhǎng)片段核酸，但依賴于DNA 水解酶的活性，而酶活性受酶解底物濃度的影響［8］。遇到核酸卷曲、核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合［9］、堿基修飾［10］等因素造成的特殊空間構(gòu)象時(shí)，核酸水解酶無(wú)法進(jìn)入而無(wú)法水解［8］。酶解反應(yīng)使DNA 測(cè)量體系內(nèi)混入大量的蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、兩性電解質(zhì)等物質(zhì)，純化過程容易導(dǎo)致DNA 損失。文獻(xiàn)報(bào)道，DNA 酶解反應(yīng)容易反應(yīng)不完全，導(dǎo)致最終測(cè)量結(jié)果偏低［10］。DNA 中磷元素的電感耦合等離子體光譜法（ICP-OES）適用于短片段、純度很高的DNA 樣品。如果DNA 測(cè)量體系中混有其它元素狀態(tài)的磷，如無(wú)機(jī)鹽中的磷元素，則會(huì)造成DNA 測(cè)量結(jié)果偏高［5］。

加熱可使得某些帶修飾的堿基從DNA 骨架上解離出來成為游離堿基［11］。在強(qiáng)酸如HCl 條件下，DNA 上的堿基與核糖連接的糖苷鍵斷裂，形成游離堿基［12］，但是容易產(chǎn)生副產(chǎn)物。弱酸（如甲酸）在加熱條件下可使得DNA 上腺嘌呤和鳥嘌呤及其修飾加合物解離為游離堿基［13-14］，該過程也可解離出游離胞嘧啶和甲基胞嘧啶，用于DNA 甲基化水平研究［15］。在此基礎(chǔ)上，筆者建立了DNA 水解產(chǎn)物的HPLC-IDMS 定量方法。

核酸的酸水解方法有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）酸解反應(yīng)耗時(shí)較短，反應(yīng)充分；（2）酸解切斷的是堿基與核糖之間的糖苷鍵［13］，不受DNA 長(zhǎng)度、序列、DNA 上結(jié)合的蛋白質(zhì)等因素的影響，水解過程進(jìn)行較充分；（3）酸解反應(yīng)不引入雜質(zhì)，只有甲酸中攜帶的痕量金屬離子，易于采用液相色譜串聯(lián)同位素稀釋質(zhì)譜的分離分析。然而酸解法也有一定的缺點(diǎn)，高濃度強(qiáng)酸可能使DNA 的水解產(chǎn)生其它反應(yīng)副產(chǎn)物，可能造成堿基進(jìn)一步降解［16］。因此需要利用選擇酸的類型、酸的濃度、酸解時(shí)間與溫度，準(zhǔn)確控制酸水解效率，以實(shí)現(xiàn)DNA 含量的準(zhǔn)確測(cè)量。

噬菌體λDNA 是一種廣泛應(yīng)用的核酸含量標(biāo)準(zhǔn)品，常用于DNA 紫外或熒光定量方法的校準(zhǔn)。噬菌體λDNA 的提取純化過程需要先分離病毒顆粒，因此很少受到細(xì)菌本身基因組DNA 和RNA 的污染，可以獲得較純凈的噬菌體DNA［17］，適合作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

水浴鍋：DK-8D 型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

pH 計(jì)：Origin 3 Star 型，美國(guó)Thermo Scientific公司；

旋渦振蕩儀：MS3 型，德國(guó)IKA 公司；

真空干燥箱：DZF-6050 型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

恒溫烘箱：UFE500 型，德國(guó)Memmert 公司；

離心機(jī)：3-15K 型，美國(guó)Sigma 公司；

純水機(jī)：MilliQ 型，美國(guó)Millipore 公司；

分析天平：CP324S 型，感量為0.01 mg，德國(guó)Sartorius 公司；

精密分析天平：UMX2 型，感量為0.1μg，瑞士Mettler Toledo 公司；

電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：TSQ Vantage 型，美國(guó)Thermo Scientific 公司；

SDS、酚、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、無(wú)機(jī)酸、無(wú)機(jī)鹽：分析純或優(yōu)級(jí)純；

乙腈、甲醇：色譜醇，美國(guó)J. T. Baker 公司；

純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：自制，分別是腺嘌呤（Ade）［純度 為(99.40±0.68)%，k=2］，胞 嘧 啶（Cyt）［純 度為(99.58±0.72)%，k=2］，鳥嘌呤（Gua）［純度為(99.96±0.18)%，k=2］，胸 腺 嘧 啶（Thy）［純 度 為(99.67±0.24)%，k=2］。其中腺嘌呤和胞嘧啶分別采用電位滴定法定值，量值溯源至酸堿國(guó)家基準(zhǔn)，鳥嘌呤和胸腺嘧啶采用液相色譜面積歸一化法定值；

同位素標(biāo)記物：13C，15N 雙標(biāo)記堿基，同位素標(biāo)記腺嘌呤（L-Ade）化學(xué)式為1，3-15N298%，同位素標(biāo)記胞嘧啶（L-Cyt）化學(xué)式為2，4-13C2，15N3（99%C，98%N），同位素標(biāo)記鳥嘌呤（L-Gua）化學(xué)式為8-13C，7，9-15N2（98%C，98%N），同位 素 標(biāo) 記 胸 腺 嘧啶（L-Thy）化學(xué)式為1，3-15N2，98%，均購(gòu)自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室（Cambridge Isotope Labotory）公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Acqurity UPLC HSS T3色 譜 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Waters 公司）；流動(dòng)相：A 為5 mmol／L NH4Ac（0.1% HAc，pH 4.0），B 為乙腈,水相配制后用0.45 μm 濾膜抽濾，并超聲脫氣；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL；流速：120 μL／min；梯 度 洗 脫：0～9 min 99%A，9～9.5 min 99%～80%A，9.5～12.5 min 80%A,12.5～13 min 80%～99%A，13～18 min 99%A。

1.2.2 質(zhì)譜條件

正電模式；噴霧電壓：3.0 kV；霧化氣：N2；霧化氣溫度：200℃；鞘氣壓力傳感器參數(shù)：20 arb；輔助氣壓力傳感器參數(shù)：5 arb；毛細(xì)管溫度：350℃；碰撞氣：Ar；一級(jí)質(zhì)譜掃描寬度（m／z）：0.002；掃描時(shí)間：0.1 s；一級(jí)質(zhì)譜半峰寬（FWHW）：0.7；二級(jí)質(zhì)譜半峰寬：0.7；微掃描時(shí)間：1 ms。

質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）的樣品離子監(jiān)測(cè)條件（包括同位素堿基標(biāo)記物）見表1。

按質(zhì)譜儀說明書配制含有咖啡因、MRFA（多聚酪氨酸短肽）和MLtramark l621 的質(zhì)量軸校準(zhǔn)液，完成質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)。

表1 質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）的樣品離子監(jiān)測(cè)條件

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的配制

稱取約1 mg 堿基和同位素標(biāo)記的堿基，分別溶于10 mL 去離子水中，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。Gua 和L-Gua 不易溶于水，溶于體積分?jǐn)?shù)3%的鹽酸溶液中，然后配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品和混合同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)品。根據(jù)λDNA 用HPLC 外標(biāo)法測(cè)得的濃度，在溶液中添加約等量的混合同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)品，同時(shí)配制與樣品濃度近似的堿基與同位素標(biāo)記堿基質(zhì)量比值約為0.90 和1.10 的高標(biāo)和低標(biāo)溶液。

1.4 DNA 水解

將基因組DNA 含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物凍干粉溶于100 μL 水，在λDNA 溶液中添加與其組成成分核苷酸含量相近的標(biāo)記核苷酸混合物。量取100 μL 樣品溶液于安瓿瓶中，真空干燥箱抽干。加入200 μL 甲酸水溶液（體積分?jǐn)?shù)為88%），充氮?dú)?，封口。?70℃恒溫烘箱內(nèi)反應(yīng)30 min，冷卻后用真空干燥箱抽干，量取加入100 μL 0.1 mol／L 鹽酸溶解，充分溶解混勻，溶液于4℃下保存。

1.5 IDMS 法堿基含量的計(jì)算

針對(duì)每一種堿基：

式中：c——堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)；

h——水解效率，%；

P——堿基標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，%；

mr——樣品中堿基同位素標(biāo)記物的質(zhì)量，g；

Rs——樣品中堿基與堿基標(biāo)記物的峰面積比；

I1——高標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的質(zhì)量比；

I2——低標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的質(zhì)量比；

R1——高標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的峰面積比；

R2——低標(biāo)溶液堿基與堿基標(biāo)記物的峰面積比；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.6 λDNA 含量的計(jì)算

由于λDNA 是一個(gè)具有49.5 kb 長(zhǎng)度的雙鏈閉環(huán)DNA。Cyt，Gua，Thy，Ade 4 種堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.96%，12.19%，10.23%，10.97%，根據(jù)4 種堿基含量計(jì)算得λDNA 總質(zhì)量，取平均值，得到同位素稀釋堿基法測(cè)量DNA 質(zhì)量的值。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA 水解條件的優(yōu)化

分別用5%鹽酸溶液于110℃水解24～48 h，用88%甲酸水溶液于140℃水解2～16 h，用88%甲酸水溶液于170℃水解15 min～4 h［13-14］。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸水解產(chǎn)物雜質(zhì)較多；甲酸140℃水解胸腺嘧啶核苷一磷酸的水解不完全；甲酸170℃水解效果較好，水解反應(yīng)完全。用88%甲酸水溶液于170℃水解30 min 回收率滿足要求，水解產(chǎn)物中4種堿基保持穩(wěn)定，因此水解條件優(yōu)化為88%甲酸水溶液于170℃水解30 min。

2.2 水解效率

根據(jù)核苷酸和基因組DNA 水解實(shí)驗(yàn)的回收率計(jì)算酸水解回收率。微生物基因組DNA 提取樣品中定量加入已知濃度的5 種堿基混合物質(zhì)控品，以1.4 步驟水解樣品并進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)量7 個(gè)樣品，計(jì)算回收率，結(jié)果表明4 種待測(cè)物堿基的回收率都在95%以上，水解效率不確定度不大于0.8%。經(jīng)過t檢驗(yàn)，4 種dNMP 溶液與λgDNA 溶液添加dNMP 溶液后水解測(cè)量的回收率無(wú)顯著性差異。另外，經(jīng)過Picogreen 熒光染料實(shí)驗(yàn)，水解產(chǎn)物沒有出現(xiàn)熒光反應(yīng)，說明水解產(chǎn)物中已不含有雙鏈DNA，即說明水解反應(yīng)完全。

2.3 色譜與質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

測(cè)試不同NH4Ac 溶液濃度和不同pH 值條件下4 種堿基的分離效果，結(jié)果表明，pH 值越大，堿基保留時(shí)間越長(zhǎng)；有機(jī)相比例越高，堿基保留時(shí)間越短?？紤]出峰時(shí)間、色譜柱的耐受性和流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜的影響，確定了1.2.1 色譜條件。

配制0.01 mg／g 同位素標(biāo)記的堿基和非標(biāo)記堿基的混合物，進(jìn)行流動(dòng)注射，選定合適的噴霧電壓和毛細(xì)管溫度，并且優(yōu)化S-lens 和碎裂CID 電壓，考慮質(zhì)譜的掃描速度、分析時(shí)間，獲得盡可能大的信號(hào)強(qiáng)度，確定了1.2.2 質(zhì)譜條件。

利用樣品與同位素標(biāo)記物混合后水解的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-IDMS 實(shí)驗(yàn)，樣品總離子流圖和子離子流圖分別見圖1～圖5。

圖1 總離子流圖

圖2 Cyt 和L-Cyt 子離子流圖

圖3 Gua 和L-Gua 子離子流圖

圖4 Ade 和L-Ade 子離子流圖

圖5 Thy 和L-Thy 子離子流圖

2.4 樣品中堿基含量的同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定

取15 支λDNA 凍干粉樣品，稱量后溶于100 μL 去離子水中，然后量取100 μL 樣品溶液，加入100 μL 同位素標(biāo)記混合樣，充分混勻。參照1.4 步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表2，由表2 可知，4 種堿基測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都在5%以內(nèi)。

按照1.6λDNA 計(jì)算方法，依據(jù)不同核苷酸在整個(gè)λDNA 序列中的比例計(jì)算λDNA 含量，將4種核苷酸堿基推算所得DNA 含量取平均值，并與數(shù)字PCR（dPCR）測(cè)量結(jié)果相比較［18］，結(jié)果見圖6。λDNA的測(cè)量結(jié)果為每支(2.51 ±0.06)μg（k=2）。由圖6可見，兩種不同原理的測(cè)量方法所得結(jié)果近似，測(cè)量值在不確定度范圍內(nèi)。

表2 λDNA 樣品中4 種堿基含量的同位素稀釋質(zhì)譜測(cè)量結(jié)果

圖6 λDNA 凍干粉樣品用IDMS 法與數(shù)字PCR 法測(cè)量結(jié)果比較

3 結(jié)語(yǔ)

基因組DNA 水解-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)量長(zhǎng)片段核酸的含量，可以將DNA 質(zhì)量溯源到堿基質(zhì)量，利用電位滴定將堿基質(zhì)量溯源到酸堿國(guó)家基準(zhǔn)，繼而溯源至國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位SI，從而建立了核酸含量溯源的方式。在優(yōu)化酸解方法的基礎(chǔ)上，采用加標(biāo)回收法測(cè)量酸解效率，通過同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)量長(zhǎng)片段DNA 含量，線性范圍約為1～1 000 μg／g，檢出限可低至100 ng／g。共測(cè)量15 個(gè)樣品，測(cè)得λDNA 的含量為每管2.51 μg，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.34%（k=2）。該方法可用于長(zhǎng)片段核酸含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，改進(jìn)后的方法適用性廣、靈敏度高、準(zhǔn)確度好。但是由于DNA 水解方法的缺點(diǎn)在于可能產(chǎn)生水解副產(chǎn)物，因此對(duì)烘箱的溫度均勻性和穩(wěn)定性均有較高的要求，并且烘箱水解時(shí)間也需要小心調(diào)整。

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