陳 華

（鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007）

山葡萄 ［Ampelopsisbreipedunculata（Maxim.）Trautr］，又名野葡萄，是葡萄科落葉藤本。葡多酚是一種植物多酚類活性物質(zhì)，能溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中，它廣泛存在于葡萄籽、葡萄皮與果汁中［1］。我國目前對葡萄籽的綜合利用尚處在初級開發(fā)階段，葡萄籽作為葡萄多酚的重要資源，日益受到人們的關(guān)注，其開發(fā)前景是廣闊的。本實(shí)驗(yàn)以山葡萄為試材，對葡萄籽多酚提取工藝進(jìn)行了初步研究。積極開發(fā)和利用葡萄籽，為葡萄籽多酚物質(zhì)的提取尋找一種低成本、高效率的方法。該實(shí)驗(yàn)利用葡萄酒加工的副產(chǎn)品，不僅可以解決環(huán)境污染問題，具有良好的生態(tài)效益；而且變廢為寶，提高了產(chǎn)品的附加值，也具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄由鞍山市鐵東區(qū)農(nóng)貿(mào)市場購買，甲醇，乙醇，丙酮均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SY2-4恒溫水浴鍋，F(xiàn)A-1604電子天平，TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取沒食子酸0.500g，加蒸餾水溶解并移入100mL容量瓶中，在6只100mL容量瓶中分別加入5.0g／L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品0、1、2、3、5、10mL，加蒸餾水定容至100mL，分別配制成濃度為0、50、100、150、250、500mg／L的試液。各吸取1mL試液于25mL容量瓶中，加蒸餾水4mL和酒石酸亞鐵溶液5mL（酒石酸亞鐵配制［2］），充分混合，再加pH值7.5磷酸鹽緩沖液至刻度，以試劑空白溶液作參比，用紫外可見分光光度計(jì)在波長540nm處測定吸光值。

1.3.2 山葡萄籽多酚的提取

本實(shí)驗(yàn)將山葡萄籽洗凈烘干粉碎，稱取0.500g，選擇水，體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇［3］和體積分?jǐn)?shù)100%的甲醇各5mL，在70℃水浴浸提20min，提取液轉(zhuǎn)入離心管中，3800r／min離心10min，取上清液，定容至5mL，吸取1mL，測定吸光度，平行測定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。確定最佳提取劑。然后研究所選提取劑及濃度，料液比，提取溫度，提取時間等條件對山葡萄籽中多酚提取的影響。并以此為基礎(chǔ)，對提取時間，提取劑濃度，料液比，提取溫度四個參數(shù)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，針對正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

葡萄籽多酚含量的計(jì)算公式為：ω＝CV／m

式中：ω-多酚含量（mg／g）；C-葡萄籽多酚質(zhì)量濃度（mg／mL）；V-提取液體積（mL）；m-葡萄籽質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以吸光值（Y）對沒食子酸濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為Y＝0.0519X-0.0588（R＝0.9981）。分析表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.00～0.06mg／mL時與吸光值具有良好的線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取劑選擇

由表1可知，不同的溶劑從葡萄籽中提取多酚類物質(zhì)，其提取量有較大差異，不同溶劑浸提葡萄籽中所得的多酚含量差別較大，其中以甲醇為浸提劑對多酚的提取效果比較好，所以提取試劑選取甲醇。

表1 不同提取劑的浸提效果比較

2.3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對葡多酚的影響

準(zhǔn)確稱取0.500g葡萄籽粉末4份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60% 、70% 、80%的甲醇5mL，70℃水浴提取20min，各提取2次，合并提取液，將其轉(zhuǎn)入離心管中。測定方法同“1.3.2”，結(jié)果參見圖2。

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對葡多酚的影響

由圖2可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的提高，葡萄籽多酚的提取量明顯增加，但體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇提取量并不高。這可能與多酚類物質(zhì)在植物中多以結(jié)合狀態(tài)存在有關(guān)，純有機(jī)溶劑不足以破壞多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)等的連接，使提取率降低。

2.4 料液比對提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取0.500g葡萄籽粉末4份，按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20m／v的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇，70℃水浴浸提20min，各提取2次，合并提取液，將其轉(zhuǎn)入離心管中。測定方法同“1.3.2”，結(jié)果參見圖3。

圖3 料液比對葡多酚的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，葡萄籽多酚的提取量呈上升趨勢。但是當(dāng)料液比增加到一定程度時，提取量便趨于穩(wěn)定。

2.5 提取時間對提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取0.500g葡萄籽粉末4份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇5mL，70℃水浴分別提取10、20、30、40min，各提取2次，合并提取液，將其轉(zhuǎn)入離心管中。測定方法同“2.3.2”，結(jié)果參見圖4。

圖4 提取時間對葡多酚的影響

由圖4可知，提取時間越長，葡萄籽多酚的提取量越高。但當(dāng)提取時間增加到一定程度時，提取量增加趨勢不明顯。

2.6 提取溫度對葡多酚的影響

準(zhǔn)確稱取0.500g葡萄籽粉末4份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇5mL，水浴溫度分別為60、70、80、90℃，提取20min，各提取2次，合并提取液，將其轉(zhuǎn)入離心管中。測定方法同“1.3.2”，結(jié)果參見圖5。

圖5 提取溫度對葡多酚的影響

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，葡萄籽多酚的提取量逐漸增加，這是因?yàn)楦邷乜梢蕴岣呷苜|(zhì)多酚的擴(kuò)散速率，從而增加了提取速率。

2.7 提取次數(shù)對葡多酚的影響

準(zhǔn)確稱取0.500g葡萄籽粉末4份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇5mL，70℃水浴提取1、2、3、4次，每次浸提20min，各提取2次，合并提取液，將其轉(zhuǎn)入離心管中。測定方法同“2.3.2”，結(jié)果參見圖6。

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，每一次葡萄籽多酚提取量明顯減少。所以考慮經(jīng)濟(jì)條件，一般提取2次。

圖6 提取次數(shù)對葡多酚的影響

2.8 L9（34）正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比為因素，選擇L9（34）正交設(shè)計(jì)，正交因素水平表2、正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。各處理重復(fù)3次。

表2 正交因素水平表

由表3正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果可知，4個影響因素中，影響多酚的提取率的主要因素是提取溫度和甲醇的體積分?jǐn)?shù)，提取時間和料液比影響相對較小，各因素對葡萄籽多酚含量的影響程度從高到低依次為：B＞A＞C＞D，即提取溫度的影響最大，其次是甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間，料液比，組合A1B2C2D2的多酚提取量最高。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.9 多酚含量計(jì)算

在甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20（m／v），70℃水浴，浸提20min的情況下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果為在540nm下山葡萄籽的多酚含量為18.981mg／g。葡萄籽多酚含量的計(jì)算公式為：ω＝CV／m。

式中：ω-多酚含量（mg／g）；C-葡萄籽多酚質(zhì)量濃度（mg／mL）；V-提取液體積（mL）；m-葡萄籽質(zhì)量（g）。

因所有分離后的提取液都稀釋10倍，所以ω＝10CV／m

葡萄籽中多酚的含量＝10CV／m＝18.981mg／g

根據(jù)最佳提取條件：體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇，料液比1∶20（m／v），70℃水浴，浸提20min。可計(jì)算出山葡萄籽中多酚的含量可達(dá)18.981mg／g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)用單因素法，以山葡萄籽為原料，選取提取劑濃度、提取時間、提取溫度、料液比作單因素試驗(yàn)，然后根據(jù)單因素結(jié)果進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)。最終確定確定上葡萄籽總多酚提取的最佳工藝條件為：體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇，料液比1∶20（g／m／v），70℃水浴，浸提20min，考慮經(jīng)濟(jì)因素，每次提取2次。山葡萄籽中多酚的含量可達(dá)18.981mg／g。

［1］ 范培紅，婁紅祥，季梅.葡萄籽多酚的研究概況［J］.國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2003，18（6）：248-255.

［2］ 李鳳英，崔蕊靜，李春華.從葡萄皮中提取多酚物質(zhì)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（4）：147-149

［3］ 呂紹杰.葡萄籽提取物及其應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，1999（4）：32-35