夏 宇，周文化，鄧學(xué)良，伍金娥

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

脂肪酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

夏 宇1，周文化2，鄧學(xué)良2，伍金娥2

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產(chǎn)品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

為獲得高產(chǎn)脂肪酶菌株，對包括白地霉在內(nèi)的數(shù)十種微生物進行了篩選。在采用油脂培養(yǎng)基進行初步篩選之后，用酸堿滴定法對菌株所分泌的脂肪酶活力進行測定，篩選獲得了高產(chǎn)脂肪酶的白地霉菌株，其酶活力達10.79 U/mL；然后對該菌株的產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基配方、pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速等條件進行優(yōu)化，得到最適產(chǎn)脂肪酶條件是：培養(yǎng)基配比的橄欖油2%、牛肉膏2%、蔗糖0.5%、(NH4)2SO40.1%，最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH值7.0、溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速225 r/min。

脂肪酶；白地霉；脂肪酶活測定； 菌株篩選；產(chǎn)酶條件

脂肪酶是一類應(yīng)用廣泛且十分重要的工具酶，它能將油脂的甘油三酯催化生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。利用脂肪酶作用于脂肪釋放出來的短鏈脂肪酸可以增加和改進食品風(fēng)味；利用脂肪酶催化醇解和酯化反應(yīng)可以生產(chǎn)各種香精酯；用專一性微生物脂肪酶可以提高食用油營養(yǎng)價值和增加食用油花色品種，并可以制備代可可酯；另外，脂肪酶還可用在酒類去濁除渣、改善面包質(zhì)量、改善蛋白發(fā)泡等方面[1]。

目前國內(nèi)外用于獲得脂肪酶的方法主要是微生物發(fā)酵法，然而選用的產(chǎn)脂肪酶微生物品種質(zhì)量層次不齊，適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)脂肪酶微生物菌種更是極度缺乏。本研究為獲得脂肪酶高產(chǎn)菌株，對眾多可能產(chǎn)脂肪酶的微生物進行了篩選。在獲得脂肪酶高產(chǎn)菌株后，為了使高產(chǎn)菌株的脂肪酶產(chǎn)量最大化，進一步探索其產(chǎn)酶的最適條件，如培養(yǎng)基的配方、最適溫度、pH值等[2-7]。本研究篩選出的脂肪酶高產(chǎn)菌株可以用于工業(yè)上生產(chǎn)脂肪酶，探索得到的最適產(chǎn)酶條件則可以指導(dǎo)科學(xué)生產(chǎn)，提高產(chǎn)量，增加效益。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用的菌株均來自于武漢工業(yè)學(xué)院食品學(xué)院微生物實驗室保藏的現(xiàn)有菌株。

（1）培養(yǎng)基：A）PDA培養(yǎng)基。即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。B）種子培養(yǎng)基。配方：蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g (或者K2HPO4·3H2O 2.62 g) ，MgSO4·7H2O 0.05 g，花生油 20 mL，去離子水1 L。 C）油脂培養(yǎng)基（pH值7.2左右）。配方：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，花生油或香油 10 g，1.6%中性紅水溶液1 mL，瓊脂15～20 g，去離子水1 L。 D）產(chǎn)（脂肪）酶培養(yǎng)基。配方：蛋白胨20 g，蔗糖5 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，花生油 20 mL，去離子水 1 L。

（2）主要試劑： A) PBS溶液（磷酸鹽緩沖溶液）； B) NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（3）PVA溶液（體積分數(shù)為2%）：配制所采用的藥品為PVA——聚乙二醇600。

（4）油脂底物溶液：量取2%PVA溶液150 mL，加入純凈優(yōu)質(zhì)的橄欖油50 mL，用磁力攪拌器（85-2型恒溫磁力攪拌器）進行快速攪拌以充分乳化?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

（5） 粗酶液的制取：從產(chǎn)酶培養(yǎng)基中取培養(yǎng)液7 mL置于10 mL的離心管中，在離心機中以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后取上清液1 mL待用。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗用儀器和設(shè)備見表1。

表1 試驗用儀器和設(shè)備Table 1 Test apparatus and devices

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的富集培養(yǎng)及初篩

將食品學(xué)院微生物實驗室保藏的一批現(xiàn)有菌株（霉菌），包括青霉、曲霉、根霉、白地霉、毛霉、黑曲霉等，接種到PDA培養(yǎng)基上進行活化。

將獲得的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)48 h后取出觀察，菌落要求生長茂盛，沒有雜菌污染。將純化菌株劃線接種到油脂培養(yǎng)基上，在霉菌培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)48 h。由于油脂培養(yǎng)基中有中性紅，因此培養(yǎng)基平板呈現(xiàn)暗紅色。觀察生長出來的菌落周圍的顏色，若出現(xiàn)透明圈，則說明該菌株產(chǎn)生并分泌了脂肪酶，將自身周圍的油脂進行了分解。

1.3.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的復(fù)篩

初篩培養(yǎng)后得到了產(chǎn)脂肪酶菌株，根據(jù)透明圈直徑的大小將透明圈較大較明顯的菌株轉(zhuǎn)接到滅過菌的種子培養(yǎng)基中，在200 r/min、28±2℃ 條件下用搖床培養(yǎng)24 h。

然后對經(jīng)過種子培養(yǎng)液培養(yǎng)的每種菌，各取1 mL種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到滅過菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在225 r/min、28±2℃條件下用搖床培養(yǎng)72 h。

1.3.3 脂肪酶活力的測定[5-8]

取2個錐形瓶，分別作為空白瓶（A）和樣品瓶（B），各加入底物溶液4.00 mL和磷酸緩沖液5.00 mL，再于A瓶中加入95%的乙醇15.00 mL，2瓶置于35±0.2℃的水浴鍋中加熱5 min，然后于A、B 2瓶中各加入待測酶液1.00 mL，立即混勻計時，在35±0.2℃的水浴鍋中準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，于B瓶中立即補加95%的乙醇15.00 mL，使反應(yīng)終止。取出后，在2瓶中各加入酚酞指示劑2滴，用配制并標(biāo)定好的約0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，直至出現(xiàn)微紅色并保持30 s不退色為其終點，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。平行實驗測定3次，保證3次測定的結(jié)果相差不超過0.5%。

酶活性的計算公式為：U=1000·n(V － V0)C/T。

式中：U為脂肪酶酶活力，U/mL；V為滴定樣品組平均消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0為滴定空白組平均消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；n為初酶液的稀釋倍數(shù)，10；T為反應(yīng)時間，15 min；1 000為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫摩爾濃度與微摩爾濃度的換算系數(shù)。

脂肪酶活力單位定義為：1 mL 酶液于溫度35℃、pH值7.5的條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1 μmol脂肪酸，以U/mL表示。用橄欖油乳化法對脂肪酶活力進行測定，記錄下消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

1.3.4 產(chǎn)酶菌株的初步鑒定

將篩選出來的脂肪酶高產(chǎn)菌株接種到PDA平板上以觀察菌落的形態(tài)、生理生化特征，并做微生物顯微鏡涂片觀察。對照微生物學(xué)實驗手冊[10]進行初步鑒定。

1.3.5 高產(chǎn)菌株的再培養(yǎng)及保存

對高產(chǎn)菌株使用PDA培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)。由于實驗的連貫性，需要對菌株進行短期保存；在篩選出高產(chǎn)菌株后，也需要對其進行長期保存[9]。

1.3.6 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

產(chǎn)酶條件的優(yōu)化主要考慮產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳氮比、不同離子及其濃度對產(chǎn)酶的影響。

將菌株接種到種子培養(yǎng)基中，于28±2℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。然后取1 mL種子液接種到多個不同成分配比的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，探討不同碳氮比及離子濃度對產(chǎn)酶的影響。采用正交實驗方案，根據(jù)單因素實驗方法確定因素和水平，選擇適合的正交表。實際實驗中選取L9（3）4正交實驗表[11]。

1.3.7 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

培養(yǎng)基的pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速以及培養(yǎng)時間等因素都會對脂肪酶產(chǎn)量造成影響。通過改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基的pH值（pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，共5組）、培養(yǎng)溫度（24、28、32、36℃，共4組溫度）、搖床轉(zhuǎn)速（175、200、225 、250 r/min，共4組轉(zhuǎn)速），探討最適產(chǎn)脂肪酶條件。條件的選取及優(yōu)化都是以測定相應(yīng)條件下所產(chǎn)生脂肪酶活力的大小為根本依據(jù)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的分離純化和篩選

經(jīng)過PDA的活化培養(yǎng)，再經(jīng)過多次純化分離（通過形態(tài)學(xué)觀察進行初步鑒定），獲得純正的實驗菌株共8種，依次為：菌A、菌B、菌C、菌D、菌E、菌F，菌G，菌H。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察可初步判斷出幾種菌株，如A為毛霉，D為白地霉（圖1-a、b），G為曲霉。

圖1 白地霉油脂培養(yǎng)基平板及純化后PDA平板Fig.1 Oil medium plate and purified PDA plate of Geotrichum candidum

經(jīng)花生油平板（即油脂培養(yǎng)基）檢測，分離出產(chǎn)生透明圈較大的菌株（如白地霉，見圖1-c、d），并通過對其脂肪酶活力的測定和比較進行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果（見表2）表明菌D（為白地霉）發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酶活性較高。綜合考慮現(xiàn)實生產(chǎn)中菌株獲得的難易程度以及發(fā)酵培養(yǎng)難易程度等因素，決定將該白地霉作為下一步的試驗菌株，并對其產(chǎn)酶條件進行探討。

2.2 菌株產(chǎn)酶基質(zhì)研究

2.2.1 菌株產(chǎn)酶碳源選擇

利用花生油、橄欖油作為脂肪源，分析其酶解活性，研究[4]表明橄欖油對產(chǎn)酶有促進作用，故以橄欖油作為誘導(dǎo)性碳源篩選產(chǎn)脂肪酶菌株,考察橄欖油對白地霉產(chǎn)酶的影響。由圖2可以看出,在復(fù)篩培養(yǎng)基中添加2%的橄欖油可以提高脂肪酶的產(chǎn)量，因此之后的實驗均以蔗糖和橄欖油組合作為菌株產(chǎn)酶的碳源。

表2 幾種菌株所產(chǎn)脂肪酶的酶活測定?Table 2 Results of several bacterial strain’s lipase activity

為確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成成分及比例，本試驗將蔗糖、橄欖油、牛肉膏、(NH4)2SO4等因素進行3個水平的正交試驗。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵，不同培養(yǎng)基對白地霉產(chǎn)酶的影響見表2、表3。結(jié)果表明橄欖油對白地霉產(chǎn)酶具有顯著的影響，各因素對產(chǎn)酶影響的大小依次為橄欖油＞牛肉膏＞(NH4)2SO4＞蔗糖。在試驗因子水平范圍內(nèi)，根據(jù)極差由大到小，確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基最優(yōu)組合為A1B1D2C2。分析結(jié)果得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配比為：橄欖油2%、牛肉膏2%、蔗糖0.5%、(NH4)2SO40.1%。

圖2 碳源與酶活性Fig.2 Carbon source and enzyme activity

表2 培養(yǎng)基配方設(shè)計Table 2 Design of formulation of medium

表3 L9（3）4正交實驗設(shè)計Table 3 Design of L9(3)4 orthogonal test

2.2.2 菌株產(chǎn)酶條件研究

（1）pH值 為了對最適pH值進行探索，將產(chǎn)酶培養(yǎng)基的pH值分為 6.00、6.50、6.65（調(diào)節(jié)前的最初pH值）、7.00、7.50、8.00 共6組。采用較低濃度（約0.05 mol/L）的NaOH 和 HCl進行滴定調(diào)節(jié)，用pH 計（酸度計）進行測定。產(chǎn)酶培養(yǎng)72 h后，依據(jù)前文介紹的方法[13]，測得酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of pH value on producing enzyme

由圖3可看出，白地霉最適產(chǎn)酶的pH值在7.0附近，說明中性環(huán)境較適合該菌的生長和產(chǎn)酶。

（2）溫度 不同溫度對白地霉產(chǎn)酶的影響見圖4。由圖4可知，白地霉在28 ℃培養(yǎng)時脂肪酶活力最高，因此確定28 ℃為最適發(fā)酵產(chǎn)酶溫度（產(chǎn)酶培養(yǎng)時間均為72 h）。

圖4 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of temperature on producing enzyme

（3） 搖床轉(zhuǎn)速 好氧微生物發(fā)酵培養(yǎng)時，溶氧量通常成為一個限制性因素。通過改變?nèi)瞧康难b液量和搖床轉(zhuǎn)速可以控制培養(yǎng)液的溶氧量。在其它條件不變的情況下，分別設(shè)定不同的搖床轉(zhuǎn)速進行搖瓶發(fā)酵試驗，并測定脂肪酶活性。取175、200、225、250 r/min共4組轉(zhuǎn)速，在28 ℃下產(chǎn)酶培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明轉(zhuǎn)速為225 r/min時酶活性較好。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of shaker speed on producing enzyme

3 結(jié) 論

實驗中分離獲得的白地霉菌株（即菌D）產(chǎn)脂肪酶活力較高，其脂肪酶活達10.79 U/mL。 產(chǎn)脂肪酶的最佳培養(yǎng)基配比為：橄欖油2%、牛肉膏2%、蔗糖0.5%、(NH4)2SO40.1%。 最適培養(yǎng)條件為 pH值7.0、溫度28℃、轉(zhuǎn)速225 r/min。

將查閱的文獻資料與本實驗的研究過程進行綜合分析可知，白地霉脂肪酶為胞外酶，也是誘導(dǎo)性脂肪酶，產(chǎn)酶需要油脂誘導(dǎo)[14-16]。由于本實驗在對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化研究時多采用的是單因素法，關(guān)于產(chǎn)酶條件優(yōu)化和優(yōu)化后脂肪酶的最大活性可以通過正交試驗或響應(yīng)面法進一步深入研究。

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Isolation of high lipase-producing strains and optimization of lipase producing conditions

XIA Yu1, ZHOU Wen-hua1, DENG Xue-liang2, WU Jin-e2
(1. School of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China ;2.National Engineering Laboratory for Rice and Byproducts Processing, Changsha 410004, Hunan, China)

The experiments were conducted in order to obtain high lipase-producing strains from dozens of microbial strains, including Geotrichum candidum. After the preliminary and qualitative screening in the oil medium, the lipase activity were determined by acidbase titration method. The strains which produced more lipase were isolated at last, of them Geotrichum candidum strains was also screened out, whose enzyme activity was up to 10.79 U/mL. Then further studies on the lipase producing conditions were conducted.The results show that the optimum medium formulation contained: olive oil 2%, beef extract 2%, sucrose 0.5%, (NH4)2SO40.1%. The optimum cultivate conditions were: pH 7.0, 28℃ , 225 r·min-1。

lipase; Geotrichum candidum; enzyme activity determination; strain screening; lipase producing conditions

S718.8；Q936

A

1673-923X(2013)09-0116-05

2013-01-14

湖南省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目（2013NK2001）

夏 宇（1990-），男，湖北十堰人，碩士研究生，主要研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與安全； E-mail：527818443@qq.com

周文化（1969-），男，湖南常德人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事食品科學(xué)教學(xué)與研究工作；

E-mail：zhowenhua@126.com

[本文編校：謝榮秀]