陳玉森，葉乃興，許文耀，劉 威，魏日鳳，劉 偉

(1.福建農(nóng)林大學植物保護學院;2.福建農(nóng)林大學茶葉科技與經(jīng)濟研究所;3.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州350002;4.寧德師范學院，福建寧德352100)

炭疽菌(Colletotrichum Corda)是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍廣泛，嚴重危害多種瓜果、蔬菜、林木及藥材等.該屬已被描述的種超過1000個，但不同學者的劃分標準不同.von Arx［1－3］以形態(tài)學特征為主要依據(jù)劃分種;Sutton［4］主張加入純培養(yǎng)學特征;Mordue［5－6］則提出以形態(tài)學、培養(yǎng)學、生理學、病理學及地理分布等綜合指標劃分種;von Arx et al［7］和Kendrick［8］強調(diào)全型(holomorph)真菌概念，認為種的劃分應建立在有性態(tài)和無性態(tài)的聯(lián)系上，種級鑒定標準應以分生孢子和附著胞形態(tài)為主、培養(yǎng)特性為輔、寄主范圍作參考的綜合特征來確定［9］.附著胞是炭疽菌產(chǎn)生的能穿透寄主組織的特殊侵染結構［10］，其形態(tài)特征既然作為種劃分的依據(jù)之一，就有必要了解影響其穩(wěn)定的因素.據(jù)報道，孢子懸浮液pH、水的硬度、葡萄糖和乙烯濃度會影響炭疽菌附著胞的生長發(fā)育［11－14］，其他因素則未明確.因此，本文研究孢子齡、葉汁種類和孢子懸液濃度對炭疽菌孢子萌發(fā)、附著胞形成及形態(tài)的影響，為探明不同菌株附著胞發(fā)育過程中的差異及了解其作為物種鑒定的適用范圍奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從福州、泉州等地的茉莉、香蕉、番石榴、大豆等22種作物上分離獲得22個炭疽病原菌株，經(jīng)鑒定［12－25］確認后，將各菌株保存在4－8℃冰箱內(nèi)，使用時移入外加4 g·L－1KNO3的PSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)產(chǎn)孢.

1.2 孢子萌發(fā)形成附著胞過程觀測

用寄主為茉莉的菌齡5 d的炭疽菌孢子，配成4.2×105個·mL－1孢子水懸液，在凹玻片上滴60 μL孢子懸液，置于皿底墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放在25℃光照培養(yǎng)箱中，經(jīng)12、24、48、72、96 h后分別觀測附著胞大小并統(tǒng)計附著胞率.

1.3 活體寄主上和用寄主汁誘導產(chǎn)生的附著胞形態(tài)特征觀測

將寄主為杧果的炭疽菌孢子用水和杧果汁配成3.4×105個·mL－1孢子懸液.各取60 μL，孢子水懸浮液滴于成熟完好的杧果表面上，孢子果汁懸浮液滴于凹玻片上，25℃、光照下保濕培養(yǎng)12 h，觀察活體寄主上和用寄主汁誘導產(chǎn)生的附著胞形態(tài)特征，測量其大小.果汁制法:杧果25 g，水1000 mL，沸煮30 min后過濾去渣，經(jīng)高壓滅菌后使用.

1.4 不同菌齡孢子萌發(fā)及附著胞觀測

將寄主為茉莉的炭疽菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將菌齡達5、7、9、11、13、15、17 d的孢子，分別用水和茉莉葉汁配成1.7×105個·mL－1孢子懸液，按1.2方法，觀測并統(tǒng)計25℃下光照12 h后的孢子萌發(fā)率和附著胞率.葉汁制法:茉莉葉片200 g，水1000 mL，沸煮30 min后過濾去渣，經(jīng)高壓滅菌后使用.

1.5 不同種類葉汁孢子懸液附著胞形態(tài)特征觀測

采集杧果、番石榴、茶樹、白菜、枇杷、刺桐、豇豆、煙草、柑橘、甜瓜、桃樹、花生、大豆、紅麻及葡萄的葉片，按1.4方法制成葉汁.將寄主為大豆的炭疽菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，用以上15種葉汁及水分別配成3.4×105個·mL－1孢子懸液，按1.2方法，觀測并統(tǒng)計25℃下光照12 h后的附著胞形狀和大小、孢子萌發(fā)率、附著胞率.

1.6 不同菌株不同濃度孢子懸液中的孢子萌發(fā)及附著胞觀測

將膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)6個菌株以及殼皮炭疽菌(C.crassipes)、蕓薹炭疽菌(C.higgisianum)、黑線炭疽菌(C.dematium)、豆類炭疽菌(C.truncatum)、毀滅炭疽菌(C.destructivum)各 1 個菌株［12－20］，分別用培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，各菌株孢子用水分別配成 3.4 ×107、3.4 ×106、3.4 ×105、3.4 ×104和 3.4×103個·mL－1等5個梯度懸液.按1.2方法，觀測并統(tǒng)計25℃下光照12 h后各菌株孢子萌發(fā)率和附著胞率.

1.7 不同菌株附著胞形態(tài)特征觀測

將膠孢炭疽菌12個菌株以及辣椒炭疽菌(C.capsici)、殼皮炭疽菌、蕓薹炭疽菌、黑線炭疽菌、豆類炭疽菌、毛豆炭疽菌(C.boninense)、瓜類炭疽菌(C.orbiculare)、葡萄刺盤孢菌(C.ampelinum)、芭蕉炭疽菌(C.musae)和毀滅炭疽菌各1個菌株［12－25］，分別用培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，各菌株孢子分別用水配成3.4×105個·mL－1孢子懸液.按1.2方法，觀測25℃下光照12 h后的附著胞形態(tài)特征.

上述6個試驗所用的水均為無菌水，pH 6.8，每個處理重復3次.

2 結果與分析

2.1 寄生于茉莉的炭疽菌孢子萌發(fā)和附著胞形成規(guī)律

結果(圖1、表1)表明，孢子在水中萌發(fā)產(chǎn)生芽管后，不斷長出分枝，后形成卵形、梨形、姜瓣形等暗褐色的附著胞，胞內(nèi)分布黑色顆粒狀物，邊緣光滑.該菌孢子常形成1個附著胞，但隨水培時間延長，單個孢子可逐漸形成多個附著胞，96 h后可見單個孢子產(chǎn)生7個附著胞且有繼續(xù)增長的趨勢，但附著胞大小均無明顯差異.

圖1 單個孢子產(chǎn)生7個附著胞(400×)Fig.1 Seven appressoria generated from a single spore(400 ×)

表1 寄生于茉莉的炭疽菌孢子形成附著胞的規(guī)律Table 1 Appressorium formation regulation of C.gloeosporioides from Arabian jasmine

2.2 炭疽菌在寄主上與用寄主汁誘導產(chǎn)生的附著胞形態(tài)差異

炭疽菌在活體寄主上與用寄主汁誘導產(chǎn)生的附著胞形態(tài)存在一定差異.寄生于杧果的炭疽菌孢子懸液滴于杧果表面，其發(fā)育的附著胞為卵形、梨形、姜瓣形，暗褐色、灰色，長 ×寬為5.7－11.4(7.9)μm ×5.9－7.5(5.6)μm;用果汁配的孢子懸液，在凹玻片上離體培育，其誘導產(chǎn)生的附著胞為梨形、卵形、姜瓣形，褐色，長 × 寬為8.4－14.9(9.7)μm ×5.9－8.1(7.2)μm.

2.3 菌齡和寄主葉汁對寄生于茉莉的炭疽菌孢子萌發(fā)及附著胞形成的影響

由表2看出，寄生于茉莉的炭疽菌孢子在水中的萌發(fā)率相對較低，且隨菌齡增大而快速下降;附著胞率則均大于81%，且隨菌齡增大而上升.菌齡5 d的孢子懸液萌發(fā)率達51.7%，附著孢率81.8%，適合于附著孢形態(tài)的觀察.

表2 菌齡和寄主葉汁對孢子萌發(fā)率及附著胞形成率的影響1)Table 2 Effects of spore age and host leaves juice on spore germination rate and appressorium formation rate of C.gloeosporioides

炭疽菌孢子在茉莉葉汁中的萌發(fā)率相對較高;但附著孢率明顯低于水培，菌齡5－7 d的孢子萌發(fā)后未形成附著胞，雖然隨菌齡增大附著胞率上升，但17 d的附著胞率也僅55.0%.這說明營養(yǎng)雖能促進孢子萌發(fā)，但抑制了附著胞的形成，不適合作為附著孢形態(tài)觀察的介質(zhì).這可能與是否需要附著胞作為病菌侵染工具有關，葉汁中的豐富營養(yǎng)物質(zhì)可供孢子吸收萌發(fā)、菌絲分枝生長，不需要附著胞建立侵染點.

2.4 不同植物葉汁對寄生于大豆的炭疽菌孢子萌發(fā)和附著胞形態(tài)特征的影響

結果(圖2、表3)表明，與水培相比，白菜、枇杷、花生、甜瓜、豇豆、杧果、桃樹、刺桐及柑橘等9種植物葉汁均能與大豆葉汁一樣促進寄生于大豆的炭疽菌孢子萌發(fā)，同時不同程度地抑制附著胞形成;茶、番石榴、煙草、葡萄等4種植物葉汁對孢子萌發(fā)和附著胞形成有顯著抑制作用，致使孢子不萌發(fā)或萌發(fā)后芽管畸形，不產(chǎn)生附著胞.經(jīng)生物學統(tǒng)計，寄生于大豆的炭疽菌孢子萌發(fā)率與附著胞率相關系數(shù)r=0.5311，說明二者間相關性不顯著.觀測還表明，寄生于大豆的炭疽菌在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的水中形成的附著胞，形態(tài)穩(wěn)定，大小均勻，主要為梨形、卵形，暗褐色，長 × 寬為 7.4－9.9(8.6)μm ×5.3－6.4(5.6)μm.在大豆、白菜等10種供試植物葉汁中該菌附著胞個體相對較大且大小不均一，部分附著胞形態(tài)發(fā)生變異，出現(xiàn)半橢圓形、姜瓣形等，大豆汁、杧果汁誘發(fā)的附著胞較水培顏色淺，為淡褐色(表3).綜合上述試驗結果，用菌齡5 d的孢子水培誘發(fā)附著孢，萌發(fā)率、附著孢率適中，形態(tài)穩(wěn)定，適合于炭疽菌種的比較鑒定.

圖2 寄主大豆的炭疽菌附著胞形態(tài)(400×)Fig.2 Appressorium morphology of C.truncatum(400 × )

表3 不同植物葉汁對寄生于大豆的炭疽菌附著胞形態(tài)特征的影響1)Table 3 Effects of some plant juices on morphological characteristics of C.truncatum

2.5 不同菌株不同孢子懸液濃度對孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響

表4顯示，懸液濃度高時炭疽菌孢子不萌發(fā)或僅極個別萌發(fā)，附著胞率低，甚至為0;隨懸液濃度降低，孢子萌發(fā)率均有不同程度的上升，附著胞率則在懸液濃度為3.4×106個·mL－1時出現(xiàn)一個峰值后下降;懸液濃度低時雖然孢子萌發(fā)率很高，但附著胞率極低.綜合來看，觀測附著胞形態(tài)特征的孢子懸液濃度應以3.4 ×105個·mL－1左右為宜.

表4 不同菌株不同孢子懸液濃度對孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響1)Table 4 Effects of spore concentrations on conidium germination and appressorium formation

2.6 22株炭疽菌附著胞形態(tài)特征比較

由表5看出，12個膠孢炭疽菌株中，寄主為茉莉、油茶等的11個菌株的附著孢形狀類型和色澤基本相同，在一個視野內(nèi)可見梨形、卵形或姜瓣形等附著胞;各菌株附著胞大小相似;未成熟的附著胞為無色或灰色，成熟時則為暗褐色.這些菌株單憑附著胞形態(tài)難以被區(qū)別開來.寄生于雷公藤的炭疽菌附著胞形狀類型較多，胞內(nèi)灰色顆粒物明顯，周邊粗齒狀，黑褐色，相對容易識別.其他10個菌株產(chǎn)生的附著胞形狀多樣，有姜瓣形、球形、不規(guī)則形、梨形及卵形等，色澤類型也較多，有灰色、褐色、黑色等，胞內(nèi)顆粒物凸出或無，與孢子形態(tài)相結合，能將菌株初步區(qū)別開來.

表5 22株炭疽菌附著胞形態(tài)特征Table 5 Appressorium morphological characteristics of Colletotrichum species from 22 hosts

3 結論與討論

5 d菌齡的孢子以水配成3.4×105個·mL－1左右的孢子懸液，在25℃光照下培養(yǎng)12 h，附著胞的形態(tài)特征穩(wěn)定，該條件較適宜孢子萌發(fā)與附著孢的觀察.用該方法誘導22株炭疽菌產(chǎn)生附著孢，對其形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)，11種炭疽菌產(chǎn)生的附著胞形態(tài)特征存在一定的差異，與孢子形態(tài)相結合，能將這些菌株初步區(qū)分出來;膠孢炭疽菌的12個菌株中，除寄生于雷公藤的炭疽菌外，其余11個菌株的附著孢形態(tài)差異不明顯，單憑肉眼觀察難以區(qū)別.Crouch et al［26－27］指出，膠孢炭疽菌復合類群下包括許多具有明顯系統(tǒng)發(fā)育分化及生理病理特征分化的不同物種，僅根據(jù)形態(tài)和寄主，已經(jīng)不足以準確鑒定種.Damm et al［28］認為，物種鑒定必須是基于基因型與表型相結合的更為完整而科學的物種概念.因此，附著胞形態(tài)差異只能作為種間鑒定的依據(jù)之一，通過觀察不同寄主的炭疽菌附著胞形態(tài)更有助于理解其病理特征的分化.

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