劉淑娟，鐘興剛，李彥

（1.湖南省農(nóng)科院茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省茶葉檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

茶是我國(guó)傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品。隨著人們生活水平的提高，茶葉的質(zhì)量衛(wèi)生狀況越來(lái)越受到人們的重視。傳統(tǒng)的茶葉農(nóng)藥殘留檢測(cè)一般是采用氣相色譜儀、質(zhì)譜儀等儀器對(duì)干茶農(nóng)殘進(jìn)行檢測(cè)，需要昂貴的儀器設(shè)備，并且樣品的前處理過(guò)程繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)?；趯?duì)茶葉農(nóng)藥殘留監(jiān)管效率的更高要求，茶葉農(nóng)殘快速檢測(cè)新技術(shù)的開發(fā)日益受到重視。

基于酶抑制的電化學(xué)傳感技術(shù)是目前農(nóng)殘快速檢測(cè)研究最為活躍的領(lǐng)域。膽堿酯酶（ChE）在與有機(jī)磷類物質(zhì)結(jié)合后，生物催化活性受到抑制，這一原理可用于有機(jī)磷生物傳感器的構(gòu)建。利用此原理構(gòu)造的有機(jī)磷生物傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、低成本和便于攜帶等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用膽堿酯酶和有機(jī)磷水解酶檢測(cè)有機(jī)磷的文獻(xiàn)已有報(bào)道[4-8]，但將這種技術(shù)用于茶葉有機(jī)磷快速檢測(cè)的報(bào)道極少。

本實(shí)驗(yàn)在金電極表面電沉積一層ZrO2納米粒子以固定乙酰膽堿酯酶，制成膽堿酯酶/ZrO2粒子層/金電極（AChE/ZrO2/Au）電流型生物傳感器，用于測(cè)定茶葉中的對(duì)氧磷。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金電極和CHI760b電化學(xué)工作站購(gòu)于中國(guó)上海辰華儀器廠；電化學(xué)反應(yīng)池為三電極系統(tǒng)，其中膽堿酯酶修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極；乙酰膽堿酯酶（500 U/mg）、氯化乙酰巰基膽堿購(gòu)于Sigma公司；對(duì)氧磷購(gòu)于國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心（沈陽(yáng)）；電化學(xué)測(cè)量的支持電解質(zhì)為0.067 mol/L的磷酸緩沖溶液（PBS），由KH2PO4和Na2HPO4配置而成；其他試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。

1.2 傳感器的制備

金電極在使用前分別用0.3 μm和0.05 μm的鋁粉拋光至鏡面，依次在6 M HNO3、丙酮和二次蒸餾水中各超聲清洗2 min，水洗并用氮?dú)獯蹈?。?shí)驗(yàn)開始前，把清洗過(guò)的金電極置于0.2 M的硫酸溶液中，在0.5～1.5 V的電位范圍內(nèi)采用循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定后，用去離子水洗滌并用氮?dú)獯蹈?。將以上處理好的金電極放入5.0 mM 的ZrOCl2·8H2O和0.1 M KCl的混合溶液中，在－1.1～＋0.7 V之間以20 mV/s的速度掃描十個(gè)循環(huán)，通過(guò)電化學(xué)掃描實(shí)現(xiàn)ZrO2納米粒子在金電極表面的電沉積，掃描完成后取出電極水洗并氮?dú)獯蹈伞鞲衅鞅砻娉?，用微量進(jìn)樣器移取10 μL乙酰膽堿酯酶溶液滴加到二氧化鋯電沉積層表面，室溫靜置2 h，即制得AChE/ZrO2/Au電極有機(jī)磷生物傳感器。

1.3 檢測(cè)方法

采用計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)對(duì)氧磷。在含2 mmol/L氯化乙酰巰基膽堿的PBS（pH 7.5）緩沖液中測(cè)定傳感器的原始響應(yīng)電流（測(cè)定電壓為0.45 V）。然后將傳感器置于對(duì)氧磷溶液中浸泡20 min，在相同條件下檢測(cè)傳感器在底物中的響應(yīng)電流，根據(jù)計(jì)時(shí)電流的減小程度計(jì)算樣品溶液中對(duì)氧磷的濃度。

1.4 傳感器的再生

將傳感器放入濃度為5.0 mmol/L的2-PAM 溶液輕度攪拌5 min，即可洗脫有機(jī)磷，再生酶的活性。再生后的傳感器經(jīng)清洗后即可用于下一次檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳感器工作原理

在金電極表面電沉積二氧化鋯納米粒子以固定乙酰膽堿酯酶，二氧化鋯納米粒子用于有機(jī)磷傳感器的構(gòu)造，可使傳感器獲得較大的比表面積，有利于增加酶的吸附量并保持生物分子（酶）的催化活性，提高傳感器的響應(yīng)性能。

抑制型酶電化學(xué)傳感器的構(gòu)建原理是依據(jù)乙酰膽堿酯酶催化活性的改變。傳感器工作時(shí)，底物氯化乙酰巰基膽堿在乙酰膽堿酯酶催化下分解成巰基膽堿和有機(jī)酸，而有機(jī)磷農(nóng)藥的磷?；c乙酰膽堿酯酶的活性中心絲氨酸羥基反應(yīng)，生成共價(jià)結(jié)合的磷?；福姑傅幕钚越档?，因而底物氯化乙酰巰基膽堿水解反應(yīng)被抑制，生成的反應(yīng)產(chǎn)物減少。實(shí)驗(yàn)通過(guò)電化學(xué)方法檢測(cè)底物氯化硫代乙酰膽堿的水解電流，按下列公式可計(jì)算有機(jī)磷對(duì)乙酰膽堿酯酶的百分抑制率[9]：

式中：A指乙酰膽堿酯酶的百分抑制率，I0指未被有機(jī)磷抑制的酶電極的響應(yīng)電流，I指被有機(jī)磷抑制后的酶電極的響應(yīng)電流。圖2顯示了電極在吸附有機(jī)磷前和被有機(jī)磷抑制活性后在底物中的循環(huán)伏安圖。從圖中可看出，被有機(jī)磷抑制后傳感器的氧化峰和還原峰（c）都明顯低于抑制前的氧化峰和還原峰（b）。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)依據(jù)底物氯化乙酰巰基膽堿濃度對(duì)緩沖液的pH值進(jìn)行了選擇。結(jié)果表明，pH 7.5的PBS磷酸緩沖溶液能較好地保持乙酰膽堿酯酶的活性，且傳感器響應(yīng)電流較大。底物氯化乙酰巰基膽堿濃度為2.0 mmol/L時(shí)，傳感器的電化學(xué)響應(yīng)最佳。

實(shí)驗(yàn)對(duì)甲基對(duì)硫磷的最佳抑制時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，乙酰膽堿酯酶的相對(duì)活性隨著有機(jī)磷抑制時(shí)間的增加相應(yīng)降低。當(dāng)抑制時(shí)間小于20 min時(shí)，乙酰膽堿酯酶的相對(duì)活性隨時(shí)間增加降低明顯；抑制時(shí)間大于20 min后，酶的相對(duì)活性不再隨抑制時(shí)間的增加有顯著變化。故實(shí)驗(yàn)選擇有機(jī)磷對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制時(shí)間為20 min。

實(shí)驗(yàn)還考察了乙酰膽堿酯酶的濃度對(duì)傳感器的響應(yīng)特性的影響。根據(jù)在其他條件相同的情況下得到的響應(yīng)電流可知，酶的活性濃度與傳感器的響應(yīng)靈敏度呈反比；但是，酶濃度過(guò)低，傳感器響應(yīng)電流強(qiáng)度減小，傳感器的檢測(cè)線性范圍會(huì)變窄。實(shí)驗(yàn)選擇乙酰膽堿酯酶的最佳濃度為50 mU/mL，既能使傳感器保持較高的靈敏度，又能獲得較寬的檢測(cè)線性范圍。

圖2 不同修飾的金電極在PBS在底物巰基膽堿中的循環(huán)伏安圖

2.3 傳感器的電流響應(yīng)

AChE/ZrO2/Au有機(jī)磷傳感器被對(duì)氧磷抑制后，在底物中的計(jì)時(shí)電流降低。對(duì)氧磷的濃度越大，對(duì)電化學(xué)信號(hào)的抑制作用越明顯，傳感器在底物氯化乙酰巰基膽堿溶液中的響應(yīng)電流越小。圖3是對(duì)氧磷濃度與膽堿酯酶抑制率的負(fù)對(duì)數(shù)曲線圖，由圖可知，抑制率與甲基對(duì)硫磷濃度在5.0×10-7～5.5×10-4g/L范圍內(nèi)成線性關(guān)系，最低檢出限為1.0×10-7g/L。

2.4 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將制好的對(duì)硫磷傳感器在相同條件下對(duì)對(duì)氧磷溶液（濃度為1.0×10-6g/L）重復(fù)測(cè)定10次，測(cè)得乙酰膽堿酯酶抑制率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.26%；將同批次制備的5支對(duì)氧磷傳感器在相同條件下測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.82%，結(jié)果表明，用本方法制作的酶電極，置于pH 7.5的磷酸緩沖液中于4℃冰箱中保存，放置20 d后仍可維持較好的活性。

圖3 對(duì)氧磷濃度對(duì)乙酰膽堿酯酶百分抑制率的校正曲線

2.5 傳感器的再生

傳感器在完成一次對(duì)氧磷檢測(cè)后，采用1.4所述的方法對(duì)傳感器進(jìn)行再生。酶電極連續(xù)檢測(cè)和再生使用6次后活性仍達(dá)到最初活性的90%以上（圖4）。

圖4 傳感器再生能力實(shí)驗(yàn)

2.6 非特異性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察了有機(jī)磷傳感器在磷酸根離子、硫酸根離子及硝酸根離子等無(wú)機(jī)離子存在下對(duì)響應(yīng)電流的影響。結(jié)果表明，在這類離子存在下，傳感器電流響應(yīng)無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)還對(duì)傳感器在氯氰菊酯、三氯殺螨醇等菊酯類和有機(jī)氯類農(nóng)藥存在時(shí)的響應(yīng)電流進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在這類農(nóng)藥殘留存在時(shí)，傳感器的響應(yīng)電流亦無(wú)明顯變化。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察了傳感器在6個(gè)不同待測(cè)茶湯樣品添加對(duì)氧磷溶液后的回收率。先按照農(nóng)藥的正確使用方法配置一定濃度的對(duì)氧磷溶液噴施多個(gè)茶葉樣品，放置過(guò)夜，將茶葉剪碎后浸入丙酮溶液中震蕩，過(guò)濾后定容至10 mL的容量瓶中。用本文提出的方法檢測(cè)樣品溶液中對(duì)氧磷的濃度。然后在各樣品中加入已知量的對(duì)氧磷溶液，再以同樣方法對(duì)添加后的樣品進(jìn)行測(cè)定，得到的平均回收率在96.05%至105.47%之間，表明試驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表1 添加回收率試驗(yàn)

2.8 與傳統(tǒng)分析方法的比較

為了考察實(shí)際應(yīng)用的可能性，實(shí)驗(yàn)用酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)5個(gè)不同對(duì)氧濃度的茶葉樣品，并將檢測(cè)結(jié)果與氣相色譜法得到的結(jié)果進(jìn)行比較，兩種方法的測(cè)定結(jié)果基本相符（表2）。

表2 用傳感器法和高效氣相色譜法分別測(cè)得的茶湯樣品中對(duì)氧磷的濃度

3 結(jié)論

茶葉有機(jī)磷農(nóng)殘含量水平直接影響人體健康，也越來(lái)越被廣大消費(fèi)者所關(guān)注。本文構(gòu)建的AChE/ZrO2/Au有機(jī)磷傳感器可直接檢測(cè)液相中的對(duì)氧磷。傳感器構(gòu)造簡(jiǎn)單，茶葉經(jīng)簡(jiǎn)單浸提即可直接用于檢測(cè)。傳感器對(duì)目標(biāo)物對(duì)氧磷的檢出限低，線性范圍寬、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且電極使用壽命較長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)便。進(jìn)一步肯定了該方法在茶葉有機(jī)磷檢測(cè)中的應(yīng)用效果，可作為茶葉有機(jī)磷殘留傳統(tǒng)檢測(cè)方法的有力補(bǔ)充。

[1]毛斌,韓根亮,李工農(nóng),等.牛物傳感器在食品農(nóng)藥和抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J].甘肅科學(xué)學(xué)報(bào),2007,19(2):72-76.

[2]ANDREESCU S,MARTY J L.Twenty years research in cholinesterase biosensors:from basic research to practical applications[J].Biomol Eng,2006,（23）:1-15.

[3]JEANTY G,CHOMMIDH C H,VTIRTY J L.Automated detection of chlorpyrifos and its metabolites by a continuous flow system based enzyme sensor[J].Anal Chim Acta,2001,(436):119-l28.

[4]ALBAREDA S M，MERKOCI A，ALEGRET S.Automated detection of chlorpyrifosandits metabolites by a continuous flow system based enzyme sensor[J].Anal Chim Acta,2001,(442):35-44.

[5]SUPRUN E,EVTUGYN G,BUDNIKOV H,et al.Electrochemical biosensors–principles and applications[J].Anal.Bioanal.Chem.,2005,(383):597-604.

[6]劉鸝,安裕敏,Sergei V.Dzyadevych,等.丁酰膽堿酯酶電勢(shì)型生物傳感器測(cè)定敵敵畏農(nóng)藥殘留的抑制性研究[J].貴州環(huán)?？萍?2006,12(2):32-35.

[7]JOSIANE C,SERGIO A S M.A review of electrolyte and electrode materials for high temperature electrochemical CO2and SO2gas sensors[J].Sens.Actuators.B,2008,(129):96-97.

[8]劉淑娟,譚正初,鐘興剛,等.基于二氧化鋯納米粒子固定乙酰膽堿酯酶的甲基對(duì)硫磷傳感器[J].傳感技術(shù)學(xué)報(bào),2009,22(5):613-617.

[9]龍亞平,張耀東,漆紅蘭,等.基于溶膠-凝膠的普魯士藍(lán)/納米金修飾玻碳電極的有機(jī)磷生物傳感器[J].藥物分析雜志,2006,(12):1702-1705.