張守都, 許 飛, 李 莉, 張國范

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071; 2.中國科學(xué)院 研究生院, 北京100049)

海灣扇貝(Argopecten irradians)原產(chǎn)于美國大西洋沿岸, 于1982年引進(jìn)我國并成為我國最重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一[1]。海灣扇貝作為雌雄同體生物可通過自交進(jìn)行繁殖, 這對育種工作十分有利, 有時(shí)只需少量個(gè)體即可成功擴(kuò)繁具有一定規(guī)模的群體。但是這種近交的便利加上我國海灣扇貝育苗產(chǎn)業(yè)的車間化等特點(diǎn), 連續(xù)多年的小規(guī)模的群體內(nèi)繁育導(dǎo)致我國海灣扇貝養(yǎng)殖群體近交衰退嚴(yán)重[2]。雖然重新引種工作可以從某種程度上解決這個(gè)問題, 但是由于對海灣扇貝這種生物的近交行為的缺乏理解和在產(chǎn)業(yè)中的一些不恰當(dāng)?shù)牟僮餍袨? 國內(nèi)海灣扇貝的產(chǎn)業(yè)的發(fā)展陷入了引種-衰退-再引種-再衰退的惡性循環(huán), 這無疑加劇了整個(gè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的成本和不便。為此人們開展了大量的關(guān)于海灣扇貝近交方面的研究[3-4]。

自體受精的繁殖方式在生物交配方式的進(jìn)化上具有舉足輕重的地位, 在生物群體高度自交和嚴(yán)重的近交衰退的情況下, 對近交的選擇壓力迫使生物群體向雜交的交配方式進(jìn)化并維持這種交配方 式[5-6]。作者研究發(fā)現(xiàn)我國海灣扇貝養(yǎng)殖群體近交衰退嚴(yán)重[2], 雖然不會(huì)在幾十年的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)交配方式的急劇變化, 但是作者探討在高度的近交衰退和面臨高強(qiáng)度的對近交的選擇壓力下海灣扇貝中國養(yǎng)殖群體的馴化反應(yīng), 包括在混交情況下的優(yōu)先受精和自然選擇壓力下的雜合子過剩問題。

1 材料與方法

1.1 親貝的獲取和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用親貝為隨機(jī)選自我國海灣扇貝養(yǎng)殖群體的紅貝和黑貝個(gè)體, 所有實(shí)驗(yàn)用親貝均同時(shí)在膠南市龍灣海珍品育值有限公司育苗車間進(jìn)行性腺促熟,培育方法參照張福綏等[1], 整個(gè)促熟過程遵循無公害食品海灣扇貝養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范NY／T 5063-2001。

1.2 產(chǎn)卵和受精

從生產(chǎn)群體中隨機(jī)挑選 10只性腺發(fā)育至第四期[7]的個(gè)體(紅、黑個(gè)體各一只)在空氣中陰干30min , 然后對每只扇貝注射的五羥色胺[8], 將每一個(gè)準(zhǔn)備好的扇貝逐一放入一個(gè)單獨(dú)容器中待產(chǎn), 每個(gè)容器中注入23℃沙濾海水, 大約30 min后所處理扇貝會(huì)首先排放精子, 收集質(zhì)量好的精子備用, 接下來中間會(huì)出現(xiàn)一個(gè)10 min左右的暫停期, 將扇貝用新鮮海水沖洗幾遍后放回?zé)? 待其進(jìn)一步排放卵子。為了進(jìn)一步防止自體受精, 第1次排放卵子棄之不用, 接下來每次收集卵子均進(jìn)行洗卵, 然后收集在顯微鏡下檢查過的未被污染的(即未自體受精)卵子備用, 這樣共分別收集到10只扇貝未受精的卵子和精子。

將10只扇貝兩兩隨機(jī)分組進(jìn)行受精, 首先根據(jù)精液在燒杯中的透光度將每組的兩只扇貝的精子分別稀釋至濃度一致, 并鏡檢判斷精子活力相一致。然后將等體積的兩個(gè)扇貝的精液混勻分別給收集好的兩只扇貝未污染的卵子受精。另外對每個(gè)扇貝的部分卵子做自體受精即自交組作為雜交組的對照。每兩只扇貝組合中共形成紅♀×混合♂, 黑♀×混合♂雙向兩個(gè)混交組和紅♀×紅♂, 黑♀×黑♂兩個(gè)自交組共4個(gè)不同遺傳組。將紅♀×混合♂, 黑♀×混合♂兩個(gè)混交組混合孵化, 在接下來中將統(tǒng)稱混交組。這樣5對扇貝組合共形成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的混交系分別命名為M1、M2、RW-01、RB-03和WP-03。

1.3 幼蟲培養(yǎng)和稚貝、親貝的養(yǎng)成

在受精卵孵化24 h后, 用300目的篩絹對孵化D形幼蟲進(jìn)行選優(yōu), 幼蟲的起始培養(yǎng)密度被設(shè)置為 10個(gè)/mL, 各組培養(yǎng)在40 L的白塑桶23℃沙濾海水中并在相同的環(huán)境條件下培養(yǎng)。幼蟲的前期餌料為金藻, 后期為金藻、扁藻和小硅藻等。 投餌量和投餌次數(shù)隨幼蟲增長而增加, 確保每天全換水一次。

8～10 d時(shí)幼蟲開始出現(xiàn)眼點(diǎn)。當(dāng)30%左右的幼蟲出現(xiàn)眼點(diǎn)時(shí)開始投放附著基(聚已烯網(wǎng)廉) 每個(gè)塑料桶中投廉片數(shù)依幼蟲多少而定。在受精20 d時(shí), 附著基被裝入60目的聚乙烯網(wǎng)袋掛至海上開始進(jìn)入海上保苗期, 隨著稚貝的長大網(wǎng)袋由 60目逐漸地更換成40目、30目。最后稚貝當(dāng)稚貝的殼長達(dá)到 5 mm 以上時(shí)也被從附著基上洗刷下來轉(zhuǎn)入18目網(wǎng)袋中培養(yǎng), 至稚貝殼長生長至2～3 cm時(shí)移入帶有標(biāo)記牌的扇貝暫養(yǎng)籠暫養(yǎng), 密度設(shè)置每層 250 個(gè)。 隨著扇貝的長大每層減少至100個(gè)再到50個(gè), 而后進(jìn)入帶有標(biāo)記牌)養(yǎng)成籠, 密度設(shè)置每層30個(gè)。幼蟲培育、稚貝的保苗和養(yǎng)成過程中任何個(gè)體沒有被隨意地丟棄。

1.4 數(shù)據(jù)測量和樣品固定

對各個(gè)混交系的受精后6 h擔(dān)輪幼蟲、1 dD形幼蟲、20 d稚貝、40 d稚貝、3個(gè)月稚貝和成貝的分別進(jìn)行取樣以酒精固定以備后期分析。并對每組的混交系和自交系的1 dD形幼蟲、20 d稚貝、40 d稚貝、3個(gè)月稚貝和成貝的殼長進(jìn)行測量。

1.5 以微衛(wèi)星進(jìn)行雜合子測定

1.5.1 DNA的提取

擔(dān)輪幼蟲和1 dD形幼蟲的DNA提取方法參照戰(zhàn)文斌等, 稚貝和成貝DNA用天根生化科技有限公司的Fast200 DNA 提取試劑盒參照廠家說明書提取。

1.5.2 以微衛(wèi)星對各個(gè)時(shí)期雜合子比例的測定

從已經(jīng)發(fā)表的海灣扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記中[9-11]為5組混交系篩選出各一對在父母本中均有特異等位基因的標(biāo)記(表1), 并以特異等位基因的雜交來判斷出混交系中的雜合子。15 μL的PCR反應(yīng)體系為1× PCR buffer, 0.34 μmol/L的引物, 200 μmol/L的dNTP, 1.5 mm MgCl2, 0.5 U Taq酶和大約50 ng的DNA 模板。所有反應(yīng)均在TaKaRa TP600 PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序設(shè)定為: 94℃5 min; 94℃30 s, 退火30 s (各引物退火溫度見表1)和72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán); 最后延伸72℃5 min。PCR 產(chǎn)物用12% 聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離, 經(jīng)EB染色后進(jìn)行熒光顯影攝像。用Gel-Pro Analyzer 軟件(version 7.0, available at http://www.mediacy.com) 進(jìn)行帶型大小的分析。

表1 用于對5組混交系雜合比例分析的5對微衛(wèi)星分子標(biāo)記的情況 Tab. 1 Primer sequences, repeat types, and PCR conditions for microsatellite loci used in this study

1.6 數(shù)據(jù)分析

雜交優(yōu)勢的計(jì)算方法參考Cruz等[8]的方法:

式中,H為雜種優(yōu)勢,C、M1和M2分別為混交組和兩個(gè)自交組在同一日齡的殼長。

對各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的雜合子比例和雜交優(yōu)勢率的數(shù)據(jù)比較用軟件SPSS 17．0的One-Way ANOVA命令進(jìn)行方差分析, 差異顯著性設(shè)為P＜0.05。

用excel的CHITEST函數(shù)對混交系的雜合子比例進(jìn)行卡方檢驗(yàn)是否發(fā)生對隨機(jī)的偏離, 對雜合子比例和雜交優(yōu)勢率的變化趨勢通過散點(diǎn)圖添加趨勢線方式進(jìn)行相關(guān)性圖例分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交優(yōu)勢率的變化

圖1列出了海灣扇貝3個(gè)混交實(shí)驗(yàn)組的混交系相對于自交組在不同時(shí)期的殼長雜交優(yōu)勢率的情況(分別以各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的混交系RW-01、RB-03和WP-03表示, 另外兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的混交系M1和M2未能獲取變態(tài)后的數(shù)據(jù), 在此未列出)。結(jié)果顯示雜交優(yōu)勢率隨著發(fā)育時(shí)間推移逐漸變大。對1 d的D形幼蟲、20 d的稚貝、40 d的稚貝、3個(gè)月的稚貝以及成貝等時(shí)期的雜交優(yōu)勢率進(jìn)行單因素方差分析顯示各個(gè)時(shí)期的雜交優(yōu)勢率的差異顯著(P<0.05)(表2)。

圖1 海灣扇貝3個(gè)混交系在發(fā)育各個(gè)時(shí)期雜交優(yōu)勢率 Fig. 1 Shell length Heterosis of three mixed families compared with their controls at six phases

表2 對發(fā)育不同時(shí)期的雜合子比例和雜交優(yōu)勢率的單因素方差分析 Tab. 2 Analyses of variance for hybrid proportions and shell length heterosis

2.2 以微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行的雜合子比例測定

用5對選定的在父母本中具有特異等位基因(圖2)的位點(diǎn)(表1), 分別對5組混交系從擔(dān)輪幼蟲(由于有兩組的擔(dān)輪幼蟲損壞, 所以擔(dān)輪期只有3組進(jìn)行了鑒定)、1 d的D形幼蟲、20 d的稚貝、40 d的稚貝、3個(gè)月的稚貝以及成貝等時(shí)期的雜交比例進(jìn)行鑒定。

圖2 父母本AA×BB模式的后代雜合情況圖示 Fig. 2 Preferential fertilization examination under AA×BB parents model

結(jié)果顯示3組混交系在擔(dān)輪幼蟲期雜合子比例均高于50%, 擔(dān)經(jīng)卡方檢驗(yàn)只有一組發(fā)生顯著偏離隨機(jī)水平(P<0.05)。隨著時(shí)間雜合子比例逐漸上升, 最高甚至達(dá)到100%(圖3)。

以發(fā)育的不同時(shí)期為因素進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn), 在不同的時(shí)期的雜合子比例具有顯著的變化(P<0.05)(表2)。

2.3 雜交優(yōu)勢率變化和雜合子比例變化的相關(guān)性分析

對雜交優(yōu)勢的變化和雜合子比例的變化進(jìn)行相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)兩者的變化呈正相關(guān)(圖4)。

3 討論

圖3 海灣扇貝5個(gè)混交系在各個(gè)時(shí)期雜合子比例的變化情況 Fig.3 The hybrid proportion of the five bay scallop mixed families at six phases

圖4 殼長雜交優(yōu)勢率變化和雜合子比例變化的相關(guān)性分析 Fig. 4 Analyses of correlativity between hybrid proportions and shell length heterosis

對一個(gè)引進(jìn)物種種群穩(wěn)定的維持是育種工作者重要的工作目標(biāo)。這對海灣扇貝這種極易自交的生 物物種尤其重要。工廠化育苗是海灣扇貝自從引種成功以后在我國的主要存在模式, 特定環(huán)境下的過小的種群數(shù)量就更加重了高度近交、自交的可能性。在這種獨(dú)特的進(jìn)化環(huán)境下人們研究自然選擇壓力對海灣扇貝交配方式的影響。生物交配方式的進(jìn)化是物種進(jìn)化的一個(gè)方面也是一個(gè)重要的手段。從長遠(yuǎn)來看研究發(fā)現(xiàn)自體受精自體受精生物在高度自交和嚴(yán)重近交衰退的情況下選擇的壓力迫使它向雜交的交配方式進(jìn)化并維持這種交配方式包括自交不匹配和雌雄異體[5-6]。但是在較短的時(shí)間內(nèi)作者認(rèn)為一個(gè)生物種群如果能生存下來雖然不能發(fā)生交配方式的劇變但必然也能對自然選擇有所應(yīng)對措施。人們之前的工作發(fā)現(xiàn)海灣扇貝雜交家系傳至第三代時(shí)即已經(jīng)很難再往下維持, 但我國海灣扇貝自引種以來已數(shù)十年卻能夠較為穩(wěn)定傳代, 那么說明在這些群體中沒有或較少自交至三代以上的個(gè)體即對自交行為存在一個(gè)較強(qiáng)的選擇壓力, 這種選擇壓力可能是來自受精前的精子選擇或者是受精后對自交個(gè)體的選擇。作者在海灣扇貝的混交家系構(gòu)建過程中發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間推移混交家系相對于自交家系的優(yōu)勢有逐漸擴(kuò)大的趨勢, 因?yàn)樵诨旖患蚁抵型瑫r(shí)存在著雜交個(gè)體和自交個(gè)體, 作者猜想在這個(gè)過程中會(huì)有對自交個(gè)體有較強(qiáng)的選擇現(xiàn)象而在混交系中凸顯雜交個(gè)體的生長優(yōu)勢。

微衛(wèi)星作為第二代共顯性分子標(biāo)記可以清晰地進(jìn)行混交家系中的后代進(jìn)行親子鑒定。作者以對受精后6h的擔(dān)輪幼蟲的雜合子比例的鑒定來作為優(yōu)先受精的判斷標(biāo)準(zhǔn)?？ǚ浇Y(jié)果顯示3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中只有1個(gè)發(fā)生隨機(jī)的偏離即不能定義中國海灣扇貝在受精時(shí)對隨機(jī)受精的偏離, 也就是在受精時(shí)卵子并沒有對自體精子和異體精子產(chǎn)生傾向性的選擇, 說明海灣扇貝引入中國的這段時(shí)間內(nèi), 雖然經(jīng)受了群體內(nèi)的高度自交和嚴(yán)重的近交衰退, 并沒有出現(xiàn)向著自交不親和或者雌雄異體等交配方式方向上的進(jìn)化, 但在D形幼蟲之后的雜合子比例卻是逐漸上升的(圖3), 這是與海灣扇貝的雜交家系一般比自交家系具有更高的存活率一致的, 即在中國海灣扇貝生長過程中雜合子的過剩是由對自交個(gè)體的選擇導(dǎo)致的, 甚至有個(gè)別家系的雜合子比例接近100%。

不同發(fā)育階段間的雜合子比例和雜種優(yōu)勢率的單因素方差分析結(jié)果顯示雜合子比例或雜種優(yōu)勢率的上升變化是顯著的(P<0.05)。而雜合子比例變化和雜種優(yōu)勢率的變化呈顯著的相關(guān)性。這是很容易理解的, 因?yàn)樵谧匀贿x擇的壓力下, 隨著混交家系中的生長劣勢的個(gè)體逐漸被淘汰而導(dǎo)致生長占優(yōu)勢的雜合個(gè)體的比例逐漸上升, 所以整個(gè)家系就表現(xiàn)出來越來越大的生長優(yōu)勢。作者認(rèn)為, 中國的海灣扇貝群體就是在這種不斷淘汰著自交個(gè)體和保留雜交個(gè)體的模式下得以傳承下來的, 即表現(xiàn)問群體中的雜合子的顯著過剩。

理解海灣扇貝的受精行為和對自然選擇的應(yīng)對對育種工作也有很大的啟發(fā), 在沒有優(yōu)先受精行為的存在下, 即所有的受精都是在精子隨機(jī)入卵的基礎(chǔ)上的進(jìn)行, 而后期生長又表現(xiàn)大量的雜合子過剩并且這一比例逐漸升高, 也即是對自交個(gè)體的一個(gè)強(qiáng)烈選擇過程。在這種情況下作者認(rèn)為如果增加有效群體數(shù)量, 則會(huì)增加雜合子的比例, 減少對自交個(gè)體的淘汰, 進(jìn)而可避免由對個(gè)體淘汰而導(dǎo)致的稀有等位基因的丟失或基因漂變, 延緩種質(zhì)的衰退。

致謝: 感謝膠南市龍灣海珍品育殖有限公司為本研究提供了實(shí)驗(yàn)所用的場地以及所有設(shè)施。

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